- 研究背景
柴胡皂苷d（Saikosaponin D）是从伞形科植物柴胡（ Bupleurum chinense DC.）和狭叶柴胡（ Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根中提取得到的一种皂苷单体成分，是柴胡的主要活性成分之一，目前研究表明，柴胡皂苷d具有抗肿瘤、抗癌、保肝、抗纤维化、免疫调节等药理作用[1]，广泛用于临床治疗。但近来年，其毒副作用也逐渐引起人们的重视。前期研究已经证实柴胡皂苷d具有较强的肝毒性[2]，但对其神经系统方面的毒性研究仍然处于初级阶段，因此需要通过进一步的药理学研究，阐明其具体的毒性作用特点，从而为其在临床上的正确使用提供依据。
神经干细胞（Neural stem cells.NSCs）是神经系统内具有自我复制更新和多向分化潜能的原始细胞，主要存在于侧脑室的室管膜下区和海马齿状回颗粒下层[3]。NSCs通过对称分裂的方式进行增殖，通过不对称分裂的方式分化为星形胶质细胞、神经元，许多神经系统疾病都与神经干细胞数量以及分化功能紊乱有关[4]，所以选用神经干细胞作为研究目标有广泛的临床应用前景。
二、研究内容
本课题主要进行的是以神经干细胞为模型，探讨柴胡皂苷d对其增殖、分化的作用及其机制。拟采用免疫荧光法检测神经干细胞标志蛋白Nestin的表达对其进行鉴定[5]，MTT比色法检测神经干细胞活性，通过EdU实验检测神经干细胞的增殖，通过对MAP2与GFAP进行免疫荧光染色检测神经干细胞的分化。
三、研究手段
- 神经干细胞培养基的配置
目前神经干细胞多用原代细胞体外培养法进行培养。由于血清中含有许多诱导NSCs分化的物质，所以常采用无血清培养[6]。在F12培养基中加入2%的B27营养因子、20mu;g/ml的表皮生长因子(EGF)和成纤维生长因子（FGF-2）可有效促进神经干细胞的分裂和增殖。
- Nestin免疫荧光染色鉴定神经干细胞
巢蛋白（ Nestin）被定义为第六类中间丝蛋白，主要在胚胎期和成年的神经干细胞一过性表达，一旦神经干细胞朝向终末方向分化为神经元和星形胶质细胞时，它便停止表达，因此可以作为检测神经干细胞的标志物[7]。
取第三代培养第四天的消化后的单细胞以适宜密度接种于用0.1g/L多聚赖氨酸包被过后的48孔板内，继续培养24h；37度预热的PBS轻轻漂洗细胞2次；40g/L多聚甲醛室温下固定细胞10min，PBS漂洗3次，每次5min；0.5%Triton-100处理细胞10min，PBS洗三次，每次5min；体积为10%的山羊血清封闭15min；弃封闭液，加入200mu;L按1:200稀释的anti-Nestin，4度孵育过夜；弃一抗，PBS洗涤3次，每次5min，用滤纸吸干多余的液体，加入200mu;L按1:200稀释的FITC-山羊抗小鼠IgG，37度温孵45min，PBS洗涤3次，每次5min，操作过程注意避光；DAPI染色3min，PBS洗涤3次，每次5min；封固后于激光共聚焦显微镜下观察。若胞浆呈红色，说明Nestin呈阳性表达。
- MTT实验检测细胞活性
MTT测定活细胞是基于黄色的四唑盐MTT能够被活细胞线粒体脱氢酶（如琥珀酸脱氢酶等）还原为难溶的蓝色结晶物甲臜（Formazan），产生的量与活细胞数目成正比，当其在二甲亚砜中溶解显色后可用比色法可检测活细胞数目[8]。
设置给药浓度分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10（mu;M/ml），并用MTT比色法测其相应的OD值，以给药浓度的log值为横坐标，细胞存活率为纵坐标拟合曲线，并从中求得柴胡皂苷d对神经干细胞活性作用的半数抑制浓度(IC50)值[9]。当给药浓度为2mu;M/ml和4mu;M/ml时，神经干细胞的存活率已经存在差异；药物浓度为5mu;M/ml时，神经干细胞已达到一半的致死率。故在后续实验中，分别采用2mu;M/ml和4mu;M/ml作为低浓度给药组和高浓度给药组研究柴胡皂苷d对神经干细胞增殖和分化的作用。
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