开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、拟研究或解决的问题
华细辛挥发油中的主要化学成分是甲基丁香酚，目前它的生物合成的完整途径仍不明确。肉桂醇脱氢酶（CAD）基因作为甲基丁香酚生物合成途径的关键酶基因，与植物生长发育和抵御病原菌入侵关系密切。本毕业设计参与到这样的一项研究工作之中，从CAD基因的克隆做起，为CAD催化步骤研究进行前期的准备工作，从而为华细辛次生代谢工程研究的开展提供操作平台。
二、采用的研究手段
最近二、三十年来，随着基因组学、代谢组学、生物信息学等新学科的兴起，新理论和新方法不断涌现，各种数据库和分析软件得以创建，同时，许多高分辨率分析仪器（GC、HPLC、UPLC、（QTOF）MS、NMR 等）投入使用，使微量/痕量物质的分离纯化和检测、大规模样品分析、海量数据的高通量运算处理、基因的克隆和功能验证等工作能力大为提升。
本毕业设计即借助新兴的分子生药学手段，从提取总RNA开始，逆转录合成双链 cDNA、扩增得到保守区序列，然后进行RACE扩增，得到目的基因的上游片段和下游片段。最后经过3个片段的拼接，得到目的基因的cDNA全长。然后再进行生物信息学分析等后续工作。
三、文献综述
摘要 目的：细辛（Asari Radix et Rhizoma）是传统中药，有解表散寒、祛风止痛、通窍、温肺化饮等功效，主治风寒表证、头痛、牙痛、风湿痹痛、鼻塞鼻渊、痰饮咳嗽、口疮，在中药中占有重要地位。它来源于马兜铃科细辛属（Asarum）植物北细辛A. heterotropoides Fr. Schmidtvar. mandshuricum (Maxim.) Kitag.、汉城细辛A. sieboldiiMiq. var. seoulense Nakai 或华细辛A. sieboldii Miq. 的干燥根和根茎[1]。华细辛为正品细辛，是细辛的道地药材。现代研究表明，细辛挥发油中的甲基丁香酚成分是中药细辛的主要有效成分和质量评价与控制指标成分，然而不同产地细辛药材的甲基丁香酚含量差异显著，严重影响用药安全性和有效性。所以阐明甲基丁香酚生物合成途径及其分子调控机制，是正确理解细辛药材质量形成规律和控制药材质量稳定性的核心理论基础。肉桂醇脱氢酶（CAD）基因作为甲基丁香酚生物合成途径的关键酶基因，依赖NADPH，催化松柏醛生成松柏醇，广泛分布在各种植物的不同组织中，被认为是木质化的一种标志[2]，对它的组成结构、酶学性质、克隆和转基因等方面的研究都较为深入，如Kim等将拟南芥9个可能的CAD重新分为三类：一类与真正的CAD同源性高、催化能力强（AtCAD4、AtCAD5）；一类与SAD同源性高、催化能力较低（AtCAD2、AtCAD3、AtCAD7、AtCAD8）；第三类为代谢途径中功能冗余基因（AtCAD6、AtCAD9）[3~9]。国内也已经有很多种植物的CAD基因得到分离和功能验证，如桉树[10]、小麦[11]等。因此，改良栽培品种，调控甲基丁香酚含量，提高细辛药材品质和资源利用效率，提供重要的理论基础。方法: 基于同源克隆的原理，通过CAD的同源序列比对，查找CAD的保守区，据此设计简并引物。以华细辛cDNA为模板进行PCR反应，获得华细辛CAD基因的核心片段。根据核心片段的序列信息，设计基因特异引物，通过cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNAEnds，RACE) 扩增CAD基因5端和3端片段。将3个分别得到的片段进行拼接，获得CAD基因的cDNA全长。 结果: 通过PCR克隆可得到CAD基因的cDNA全长。结论:首次从华细辛叶片中克隆得到CAD基因，为华细辛甲基丁香酚的生源途径研究奠定基础。
关键词 华细辛; 肉桂醇脱氢酶（CAD）基因;基因克隆; 生物信息学分析;
正文 甲基丁香酚是细辛的主要药理活性成分，通过华细辛甲基丁香酚生物合成途径中CAD酶基因的克隆和功能验证，探讨细辛甲基丁香酚生物合成分子调控机制，将对细辛质量评价和控制、细辛种质遗传改良、细辛资源合理开发利用和资源保护提供关键理论基础，保证用药的安全性和有效性。本毕业设计首先完成第一步，即CAD基因的克隆。采用的技术手段主要依靠分子生物学手段，需要学习和掌握植物总RNA/DNA提取、PCR反应、凝胶电泳、植物基因克隆、RACE扩增等的基本操作技能。所以前期做了大量的理论和技术上的准备工作。
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