开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 研究目的与意义
肿瘤多细胞球是一种经典的体外三维肿瘤细胞培养模型。肿瘤细胞以多细胞集聚体的形式生长，成为具有三维结构的细胞团块。其在形态上类似肿瘤小结，并具有活体肿瘤组织的诸多特点。在很多方面优于其他体外培养技术。自从Sutherland等把细胞球作为结节性癌的模型用于研究以来,人们相继利用球体来模拟实体瘤用于肿瘤生物学和实验治疗研究。现在，肿瘤球体外模型，已经变成了生命科学中一项非常基础、应用非常广泛的技术。
肿瘤细胞球细胞紧密排列。整个细胞球从内到外存在氧气、营养物质的梯度分布。球体生长过程是一个周期细胞向非周期细胞的发展过程，最后形成一个包含周期细胞、非周期细胞、少氧细胞和衰亡细胞的异质体。它的生长速度比单层细胞慢。这些都与实体瘤性质相似。本实验主要目的在于尝试构建脑胶质瘤细胞的肿瘤球模型，通过PI荧光法测定其细胞坏死情况，对其生长特性进行评价，并利用药物抑制细胞球生长，通过测算细胞球体积判断对其生长产生的抑制效果。
- 拟研究或解决的问题
- 肿瘤细胞的培养及多细胞肿瘤球构建
- 肿瘤球生长抑制评价
- 肿瘤球细胞坏死考察
- 研究方法和手段
- 肿瘤细胞培养
- 肿瘤细胞复苏及换液
将冻存的C6和U87细胞取出后，立即用37 ordm;C水浴迅速融化。加入无血清培养基，
边滴加边轻轻震摇离心管管，使冻存液稀释至10mL。用封口膜将离心管口封好后，1000 rpm，离心5min，收集细胞。弃去上清，加入适量培养基，轻轻吹打，重悬细胞后，将细胞悬液加入玻璃培养瓶中，加入1mL血清，并补加培养基至终体积为5mL。使细胞均匀分布于瓶底后，置于37 ordm;C，含5%CO2的培养箱中静置培养。细胞充分贴壁生长后，弃去培养基，用无菌PBS润洗2次后，补充新鲜的含10%血清的培养基，继续培养。
- 肿瘤细胞传代
弃去培养基，用无菌PBS润洗两遍后，加入适量胰酶，37 ordm;C反应一段时间后，取出置于显微镜下观察，待细胞消化至近似圆形即可。弃去胰酶，加入适量无血清培养基。轻轻吹打，使细胞从壁上脱落，将细胞悬液分装至多个细胞培养瓶中，补加加入培养基及10%的血清至终体积为5mL。继续放入培养箱中培养，按时换液，每次观察细胞生长情况。
- 预期结果
①若细胞生长速率正常、状态良好则将其下次传代时接种到琼脂板上，构建细胞球。②若生长状态不好：速率慢或者形态不正常，则重新复苏，培养。
- 胶质瘤多细胞肿瘤球构建
- Agar-MEM培养皿包被
用PBS配制1.5%(W/V)的琼脂溶液，经高温高压灭菌后，用37 ordm;C温育的，含20%血清的MEM培养基稀释一倍，趁热倒入直径为90mm的细胞培养皿中，使琼脂层厚度为2-3mm最佳。室温放置，使其充分凝固。
- 细胞球构建
肿瘤细胞经胰酶消化后，用含20%血清的MEM培养基重悬。吹打均匀后，取少量细胞悬液，利用虹吸作用滴加到带有盖玻片的血球计数板上，在显微镜下计数。调整Agar- MEM培养皿中的细胞数量至合适密度，约2~6times;106范围内。补加含20%血清的MEM完全培养基至终体积为15mL。置于37 ordm;C，含5%CO2的培养箱中静置培养。一般4天后换液，若期间培养基颜色变化大，可提前换液。换液前将含有细胞球的培养基转移到50mL无菌离心管中，静止10-15min，使细胞球重复沉淀。用移液枪吸弃上层培养基，补加新鲜完全培养基，在Agar-MEM培养皿中继续培养。
- 预期结果
①若肿瘤球构建成功，则可进一步确认细胞球内坏死状况，并进行下一步药物抑制生长实验。②若细胞未形成规则球形，则可调整细胞密度或更换其他细胞重复实验。
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