开题报告
课题名称：新型Nrf2激活剂的设计、合成和生物活性评价
一、课题背景：
Keap1-Nrf2-ARE途径在保护细胞免受氧化和/或亲电子压力中发挥重要作用。 Nrf2-ARE激活剂可以诱导一系列预防氧化损伤，炎症和肿瘤发生至关重要的细胞保护基因，并且这种能力可以被用于抗氧化剂，抗炎剂和抗癌剂中。
Keap1-Nrf2-ARE途径介绍：
由外在和内在产生的氧化和还原物质对人体产生不可避免的威胁。氧化还原物质损害了哺乳动物细胞的正常功能，比如通过破坏脂质体，蛋白质，核酸等。这些影响效果与衰老和老年化有关的疾病密切相关，例如神经退行性疾病和心血管疾病。为了应对氧化还原物质引起的压力，细胞具备多层防御机制。然而，这些防御系统的基础活动水平足以在正常条件下保护细胞免受各种氧化应激。 因此，根据胁迫水平能够调节脱毒酶和异源转运蛋白表达的调节是复杂防御系统不可或缺的。Nrf2是一种碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子，是诱导型细胞防御系统的主要组成部分，它介导100多种氧化应激相关基因的表达，包括抗氧化蛋白，I相和II相解毒酶，转运蛋白，蛋白酶体亚基，分子伴侣，生长因子及其受体和一些转录因子。这些细胞保护基因都含有顺式调控元件序列ARE，其是Nrf2在其启动子调控区的结合靶点。Nrf2活性受Keap1（一种基于Cullin3（Cul3）的E3连接酶的衔接蛋白）的严格调控。 在正常的生理条件下，Keap1组成性地靶向Nrf2用于泛素依赖性蛋白酶体降解。氧化应激后，Keap1失活，Nrf2的泛素化停止，导致新合成的Nrf2的积累和Nrf2的同时活化。从而，Nrf2转运进入细胞核，诱导一系列细胞保护基因的转录，最终导致防御系统的激活。简言之，Keap1-Nrf2-ARE信号通路可调节细胞的氧化还原状态以维持细胞稳态。许多研究表明Nrf2在氧化应激和其他类型应激的细胞适应性反应中发挥重要作用，并且这些反应可能导致炎症疾病。相反，在恶性转化细胞中，应抑制Nrf2活性以破坏细胞稳态并损害细胞保护机制。 抑制Nrf2活性可以增强化疗药物的疗效，这种方法也被认为是癌症治疗的替代策略。
Keap1在调节Nrf2活性中的作用：
Keap1被认为是Nrf2相互作用蛋白，负调节Nrf2的活性。Keap1因此被认为是抑制Nrf2的抑制因子（INrf2）。Keap1作为Nrf2的抑制性抑制因子主要集中在Keap1依赖的Nrf2的泛素化。 Keap1作为负责Nrf2泛素化的基于Cul3的泛素化E3连接酶的适配器组分。Keap1主要有5个结构区域，NTD，BTB，IVR，DGR和CTR。DGR和CTR也被称为DC域，它介导Keap1和Nrf2之间的关联。Keap1还可以作为细胞氧化还原状态的传感器。Keap1的超敏半胱氨酸残基可以监测细胞环境是否处于氧化还原平衡状态，并且它会根据氧化还原状态调控Nrf2介导的响应。具体而言，在正常条件下，Keap1靶向Nrf2进行泛素化，作为Cul3-E3泛素连接酶的底物衔接子组分导致26S蛋白酶体后续降解Nrf2。而在胁迫条件下，过量的活性氧和亲电子试剂可共价修饰这些半胱氨酸残基，导致Cul3-Keap1-Nrf2复合物的构象改变。 结果，Keap1介导的Nrf2抑制被消除并且Nrf2诱导的抗氧化系统开启。
二、设计思路：
目前已知的Keap1-Nrf2-ARE信号通路的调控方式有以下几种：（1）共价修饰关键半胱氨酸残基（2）直接干扰Keap1-Nrf2或Keap1-Cul3的PPI （蛋白-蛋白相互作用）（3）干扰Nrf2翻译后修饰（4）干扰Nrf2的转录。其中后两者为Nrf2的抑制方式，前两者为Nrf2的激活方式。在这四种调控方式中，共价修饰关键半胱氨酸残基，以及直接干扰Keap1-Nrf2 PPI（蛋白-蛋白相互作用）是目前研究较多的两种调控方式。由于共价结合的Nrf2激活剂缺乏选择性和专一性，导致该类激活剂容易造成脱靶效应，造成意想不到的毒副作用。与之相比，竞争性的、直接干扰Keap1参与的PPI （蛋白-蛋白相互作用）的Nrf2激活剂就具有一定的优势。因此，直接破坏Keap1-Nrf2蛋白-蛋白相互作用是调节Nrf2活性的新策略，是设计Nrf2激活剂的新的思路。通过设计与Keap1紧密结合的小分子，干扰Keap1与Nrf2的结合，从而抑制Nrf2的泛素化降解，致使新合成的Nrf2的积累和Nrf2的同时活化。
Keap1与底物结合腔为小分子提供了锚定位点。一般而言，Keap 1中的结合腔可以分成称为P 1 ~P 5的5个亚口袋。极性子袋P1和P2在与底物结合中起重要作用。P1由残基Ser508，Phe478，Ile461，Arg483和Arg415形成，带正电; 并与Arg483和Arg415具有静电相互作用，这对于结合具有重要意义。P2子袋由Ser363，Arg380，Asn382和Asn414组成，也带有正电荷。 值得注意的是，Arg415可以同时与P1和P2相互作用。 P3子袋由Gly509Ala556，Ser555，Ser602，Gly603和Gly571形成并占据肽主链。 这些氨基酸残基的小尺寸使这个口袋对空间位阻敏感。
结合能计算的结果表明，范德华的贡献是结合能的主要来源，这表明完全占据Keap1中的五个子袋对于加强结合亲和力非常重要，这可以作为开发针对Keap1抑制剂的良好起点。 Keap1的极性子袋（P1和P2）和非极性子袋（P4和P5）对分子间相互作用作出重要贡献。在P1和P2亚口袋中，恰好位于腔中且恰当地连接到支架上的羧甲基组对Keap1结合作出了重要贡献。 Nrf2的ETGE基序中的Glu残基就是一个很好的例子。在P4和P5亚子袋子中，疏水片段如Leu，Ile和Phe是有利的。P3的亚子袋在结合能方面是不必要的，MD模拟研究表明P3亚子袋可以被肽底物的支架占据。 保守的氢键在稳定结合构象中起到非常重要的作用。这些信息带给我们设计有效的Keap1抑制剂，即Nrf2-ARE激活剂，新的设计思路和策略。
三、研究方法：
化合物的合成：
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