【课题名称】过表达Reg4蛋白的胰腺癌细胞模型构建及其重组蛋白的制备(李金璞)一、拟研究或解决的问题：近年来，结肠癌、胰腺癌的发病率逐年升高，死亡率居高不下，其原因是这类癌症的早期诊断效果不好，以致不能尽早发现肿瘤病灶从而进行及时的治疗，耽误了最佳的治疗期。
同时，胰腺癌细胞的迁移及侵染能力强，是预后最差的恶性肿瘤之一。
研究发现，Reg4在胰腺、胃肠道的病变区有很高程度的表达，因此Reg4可能是一个有效的提示早期癌发生的重要指标；此外Reg4的表达还有助于胰腺癌细胞的增殖及迁移，也有助于癌细胞对放、化疗产生耐受。
在此基础上，研究抗Reg4的抗体，用以抑制恶性肿瘤细胞的发展，为结肠癌和胰腺癌等胃肠道癌症的治疗提供了可能。
为了制备具有抗Reg4的单克隆抗体，我们首先需要对抗原（Reg4）进行深入了解及研究，并对Reg4进行有效制备，才能为筛选抗Reg4类单抗药物提供可能性，这也是该类抗体药物筛选的必要前提及药效研究的可靠保障。
鉴于此，同时根据本实验室的实际情况，初步提出本课题主要研究方向及解决的问题如下：1.原核菌株的构建及蛋白表达纯化：（1） DH5alpha;-pET28a-Reg4克隆载体的构建；（2） T7-pET28a-Reg4表达载体的构建；（3） pET28a-Reg4工程菌的鉴定；（4） Reg4蛋白的表达及纯化；（5） Reg4蛋白的活性鉴定；2.真核细胞转染获得过表达Reg4蛋白模型：（1） PANC-1、CACO-2肿瘤细胞的培养（2） pcDNA3.1( )-Reg4质粒构建（3） pcDNA3.1( )-Reg4质粒转染（4） G418筛选稳转细胞株二、研究手段：本课题利用分子生物学技术手段，结合生物化学等纯化、鉴定及检测方法，尝试使该基因在原核细胞中实现体外表达，由PCR合成Reg4基因，利用pET系列高效表达载体之一pET28a，构建质粒将其转入T7 E.coli表达载体中，进行包涵体表达，并通过镍柱纯化及透析复性获得结构正确的蛋白产物，并对该蛋白产物进行合理的活性检测，使该蛋白作为一种抗原物质为后续抗体的筛选制备奠定基础。
过表达Reg4细胞模型的构建主要应用脂质体转染技术，后期通过G418进行筛选，并以WB检测稳转细胞株是否转染成功。
该过表达模型主要用于构建胰腺癌动物模型。
其中可能涉足的研究技术手段如下：PCR技术、琼脂糖凝胶电泳技术、PCR产物纯化、质粒的提取、感受态细胞的制备、双酶切及酶连反应、菌株转化及鉴定、SDS-PAGE技术、Ni柱纯化技术、细胞培养、脂质体转染、蛋白免疫荧光鉴定等。
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