一、 研究目的及意义癌症是严重威胁人类生命健康的杀手，传统的治疗方法，如放疗、化疗，会同时杀伤肿瘤细胞和正常细胞且副作用大。
因此寻找特异、高效的肿瘤治疗方法一直是肿瘤研究的热点。
抗TNFalpha;抗体在治疗癌症的临床研究中大多数显示出良好的耐受性，但是治疗效果并不理想。
主要原因是这些抗体缺乏对肿瘤组织的特异性，无法充分中和肿瘤微环境中的TNFalpha;。
因此，开发组织特异性强的抗体，提高其在肿瘤微环境中的靶向性、渗透性显得尤为重要。
基于抗TNFalpha;纳米抗体相对分子量小、穿透性强、位阻效应小的抗肿瘤优势，本实验以整合素alpha;ⅴbeta;3为肿瘤靶点，RGD4C为靶向载体，构建anti-TNFalpha;-VHH-RGD4C融合蛋白，利用RGD4C特异性结合整合素alpha;ⅴbeta;3的作用将TNFalpha;纳米抗体靶向导入肿瘤组织中，不影响正常细胞、组织或器官的功能，从而减少毒副作用，提高疗效。
二、 研究或解决的问题1、 探究毕赤酵母表达系统表达anti-TNFalpha;-VHH-RGD4C融合蛋白的能力2、 通过镍柱亲和层析完成anti-TNFalpha;-VHH-RGD4C融合蛋白的纯化3、 用ELISA测定anti-TNFalpha;-VHH-RGD4C融合蛋白的抗原亲和活性三、 研究方法及手段1、anti-TNFalpha;-VHH-RGD4C融合蛋白毕赤酵母表达系统的构建1.1 anti-TNFalpha;-VHH-RGD4C融合基因的构建（1）Anti-TNFalpha;-VHH基因宿主菌的活化（2）含Anti-TNFalpha;-VHH基因质粒的提取：高纯度质粒小提试剂盒（3）Anti-TNFalpha;-VHH基因与RGD-4C基因的PCR扩增，扩增产物琼脂糖凝胶电泳验证并且回收产物。
（4）Overlap PCR:采用PCR方法构建anti-TNFalpha;-VHH-RGD4C融合基因，并对产物进行琼脂糖凝胶电泳回收产物。
（5）重组质粒并扩增：将Anti-TNFalpha;-VHH-RGD4C连接至pPICZalpha;A表达载体构建重组质粒。
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