开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 拟研究的问题
本实验旨在研究色素上皮衍生因子（PEDF）对于急性肺损伤中肺微血管内皮细胞的修复作用，通过利用PLVTH构建PEDF的慢病毒表达载体，将其转导到骨髓间充质干细胞（MSC）中，使其在间充质干细胞中过表达，之后利用干细胞对受损部位的归巢作用，使之富集到受损的肺微血管部位，并在受损部分释放足量的PEDF,进而降低肺微血管内皮细胞的通透性，抑制炎症因子释放，最终减轻肺损伤达到治疗效果。本次实验主要工作是利用PLVTH和PEDF基因构建慢病毒表达载体，将其包装成病毒，并转导入骨髓间充质干细胞中，从而得到能过表达PEDF的MSC。
二、研究目标、采用的手段
- 研究目标：利用慢病毒载体PLVTH构建含PEDF基因的高效重组载体，病毒包装质粒共转染293T细胞后，使用高质量的病毒液感染干细胞，从而获得过表达的MSCs-PEDF。
- 研究手段
- 载体的构建和鉴定：根据PEDF基因CDS序列，合成PEDF基因并进行基因序列验证。利用限制性内切酶（PemⅠ、SpeⅠ）与T4连接酶将合成的PEDF构建至PLVTH载体上。
- 感受态细胞的制备与转化：制备感受态细胞DHa5，将重组质粒转化到感受态细胞中，利用抗性基因进行扩增筛选，筛选所得阳性克隆进行下一步实验。
- 质粒提取与过表达慢病毒颗粒的包装：从扩增后的菌液中提取质粒，将包膜质粒、包装质粒、载体质粒转染293T细胞，进行病毒的包装和生产，收集培养液上清，经离心，过滤等得到慢病毒颗粒，检测病毒滴度。
- 慢病毒感染目的细胞：使用高质量的病毒液感染骨髓间充质干细胞。
- 检测MSCs-PEDF中PEDF的表达:Western blot或ELISA法检测目的产物的表达。
- 文献综述
急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是一种临床常见的危重病症，也是现代危重医学的一大难题。其主要病理特征是肺上皮细胞和内皮细胞屏障广泛性受损，肺毛细血管弥漫性损伤、通透性增强，中性粒细胞涌入肺组织，肺内促炎和抗炎因子失衡。严重的ALI极易发展为急性呼吸窘迫综合症（acute respiratory ditress syndrome，ARDS），以进行性呼吸窘迫和难治性低氧血症为临床特征。目前临床上传统的治疗方法一般以尽早去除诱因、控制感染、机械通气及器官功能支持治疗为主，以最大限度地减少细胞损伤的数量和程度，但治疗效果未取得实质性突破，未能有效的阻止病程的发展，死亡率高达40%，因此寻找新的有效的治疗急性肺损伤的方法成为亟待解决的重要课题。
色素上皮衍生因子（Pigment epithelium-derived factor，PEDF）最早发现于胎儿视网膜色素上皮细胞的培养液中，是一种神经活性因子。DNA序列分析显示PEDF属于丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor，Serpin）基因家族，这个家族包括大量功能各异的蛋白质，如卵清蛋白、血管紧张素原等，有趣的是在这个家族中纬度PEDF不具备抗蛋白酶活性。PEDF的两个区域：N-末端的（44～121氨基酸）神经营养区和C-末端的丝氨酸蛋白酶抑制物超基因家族反应环（382氨基酸）使它的两个主要功能区。尽管PEDF最初是在眼睛被鉴定的，但它广泛地分布于许多组织，例如脑、脊髓、肝、心、胎盘、骨、胰腺和前列腺。
PEDF的主要作用主要是抑制新生血管作用，与血管内皮生长因子（VEGF)等细胞因子一起调节血管的通透性，抑制新生血管的发生过程。它的作用机制可能是通过诱导内皮细胞凋亡，通过与细胞外基质（ECM）连接，调节其抑制血管内皮细胞增生的活性或者通过其抗氧化特性减轻糖基化终产物对血管内皮细胞的损害。PEDF可显著地抑制VEGF诱导的内皮细胞的增生和移行。一项研究显示PEDF可抑制VEGF诱导的血管渗透性增加。
骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有向多种细胞分化潜能的细胞，是一种理想的组织工程种子细胞，易于提取，分离及扩散，在特定的条件下可以分化为骨、软骨、肌肉等中胚层组织细胞，还可以跨胚层分化为神经细胞等。MSC具有支持造血、调节免疫的生理功能及以下生物学特性：具有较强的增殖能力，能自我更新；具有多项分化潜能，具有明显的可塑性，在体内可向多种骨髓间充质以外组织迁移定位并分化为相应的组织细胞；免疫原性弱，可移植,MSCs属于未分化的前体干细胞，其表型分化尚不成熟，因此骨髓MSCs移植同种异体后无排斥反应或反应较弱；不致瘤性，安全。
PLVTH载体是属于慢病毒载体的一种，是由HIV-1而衍生而来的分子生物学中常用的一种载体系统。慢病毒载体是其载体系统的重要组成部分，包含了质粒包装，转染靶细胞，整合到宿主主基因所需要的整个遗传信息。该系统通常由载体及包装两种成分构成。包装系统含有病毒形成必要的外壳蛋白，载体系统包括顺式作用原件、多克隆位点及目标基因，这两种成分相互互补从而构建特定的病毒颗粒。慢病毒最大的优势便是它对于任何状态的细胞都具备很强的侵袭力，并且研究表明它几乎可以侵染所有类型的细胞。通过该载体能够把目标DNA高效的导进靶细胞基因组中，并且能够恒久有效的存在于靶细胞。因此在基因治疗方面有着广阔的应用前景。将目的基因连接在慢病毒载体上，通过包装质粒及慢病毒包装细胞的共同作用可以产生有感染能力的含有目的基因的病毒颗粒。
四、参考文献
1. Ware LB, Matthay MA (2000) The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med342:1334–1349.
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