一、课题解决的问题
谷氨酸-丙酮酸转氨酶，也称谷丙转氨酶（ALT或GPT），主要存在于哺乳动物心脏，肝脏细胞中，转氨酶为动物体内重要的一类酶，主要参与体内氨基酸或蛋白质的合成和分解，其中的谷-丙转氨酶ALT是由两条多肽链组成，分子量为110 kDa。等电点PI 6.45，其在肝细胞中其作用机制为，ALT把丙氨酸的氨基转移给alpha;-酮戊二酸，把酮戊二酸的羰基转移给丙氨酸，转氨基作用使得丙氨酸成为丙酮酸，alpha;-酮戊二酸成为谷氨酸。一般在肝脏或心脏出现病变时细胞死亡，会使得细胞内的ALT大量释放，因此在临床诊断上可利用血液中的ALT水平可间接性检测诊断肝脏疾病，在指标超出常规（0～40U/L）时可确切结合病人当时的体征，临床症状、以往病史等全面分析确认病因。并且血液中的ALT活力水平，也可以评估天然产物或新合成的化学药物对肝脏的毒性效应。而测量血液血清ALT水平需要ALT纯品进行物理化学性质定量，定性的分析，因此对ALT的研究是有必要的，本实验意在提供对ALT的制备以及动物体内酶或蛋白质的分离提取技术和在其质量标准研究实验进行前对本次实验进行可执行的思路。且在实验中摸索，适当选择更加简便易操作的方法得到产品。
- 研究方法和技术路线
利用动物肝脏为材料通过匀浆、高速离心、离子交换层析，凝胶层析等方法分离、纯化得到谷丙转氨酶，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析所得产物是否纯品或纯度是否达标，并对酶活性进行测定。
实验步骤：粗分离：将冰箱中4℃保存的牛心取出500g，剪碎，并加入提前配制好的5 mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液500ml，放入组织破碎机中破碎制成匀浆，用离心机8000转离心30min。弃沉淀，取上清液，加入硫酸铵固体至溶液50%饱和，4℃过夜沉淀，沉淀后酶液进行8000转离心30min，弃上清，取沉淀，加入硫酸铵固体至溶液50%饱和，过夜沉淀，弃上清，沉淀溶于100ml水中。调节酶液pH至pH 7，55℃保温5min，迅速降温到4℃保持15min，酶液8000转离心20min，去沉淀，取上清，得到溶液。
透析：将提前用0.01mol/L EDTA溶液煮沸处理，之后保存0.01mol/L EDTA中的透析袋用蒸馏水冲洗干净，将酶溶液转移到透析袋中在磁力搅拌作用下用蒸馏水进行透析，透析进行至少7次，前3次每20min换一次透析液，后四次每30min换一次透析液，直到透析液不与HCl酸化的BaCl2溶液产生白色沉淀（后期硫酸根含量少需对透析液进行检测时加入HCl/BaCl2至少静置30s轻轻震荡观察是否有白色沉淀），则为硫酸铵已除净得到脱盐酶液。若还存在白色沉淀，则继续换透析液继续透析或进行一夜透析，脱盐后酶液中存在任何不溶絮状物或沉淀，均需离心取上清液，得到脱盐酶清液
纯化：DEAE-阴离子交换纤维素（弱碱性阴离子交换剂）的制备，将20g DEAE纤维素DE-52浸泡在2L蒸馏水中1小时左右，再浸泡在300ml 0.5mol/L的NaOH溶液中0.5h，用蒸馏水洗至pH呈中性，抽滤，再用300ml 0.5 mol/L的HCl溶液浸泡0.5h，用蒸馏水洗至pH呈中性，抽滤，再浸泡在300ml 0.5mol/L的NaOH溶液中0.5h，用蒸馏水洗至pH呈中性，抽滤即可。取20g预处理过的DEAE纤维素DE-52，加入50ml 5 mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液，静置10min，然后除去上清液中的细小颗粒，重复数次，直到上清液的pH值与磷酸盐缓冲液的pH相同。用5 mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液平衡DEAE-纤维素柱（1.5cmtimes;25cm）（对于用过的纤维素，可以重复利用多次，但需要经过再生处理后才可以使用。再生处理可先用高浓度NaCl (1－2 mol/L)过柱冲洗柱床，以除去DEAE－52阴离子交换纤维所吸附的成份。然后，再用0.5 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液处理，处理方法与预处理相同。）。用脱盐酶清液进行上样，用5 mmol/L pH7.4缓冲液洗涤到基线平稳，用50，100，200，300，400，500 mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液洗脱，速度为2ml／min。收集显示酶活性组分，活性组分进行浓缩，加入赋形剂，冷冻干燥后即得谷丙转氨酶冻干粉。
三、论文课题研究进度安排
2020年1月10日----4月13日 确定选题，查阅文献。
2020年4月13日----5月22日 撰写开题报告。
2020年4月13日----6月01日 收集资料、进行设计。
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