- 研究背景
受体酪氨酸激酶（RTKs，receptors tyrosine kinase）是最大的一类酶联受体，它既是受体，又是酶，能够同配体结合，并将靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化。磷酸化的下游信号蛋白被激活，从而将细胞信号逐级传递下去，可以调节细胞的增殖、迁移、分化和凋亡。成纤维细胞生长因子受体（FGFR，fibroblast growth factor receptors）是RTKs中的一类重要受体，它在多种不同的细胞类型中都有表达，是调节细胞行为的关键受体蛋白，它可以调节细胞的增殖、分化和存活，这也使得FGF信号通路有致癌潜能，但同时FGF信号具有肿瘤抑制的功能。膀胱癌与FGF信号通路突变有着密切的联系[1]。大约50%的膀胱癌患者都在FGFR3的编码序列上发生了突变。激活的突变大多发生在激酶结构域上，超过一半的FGFR3突变发生在胞外区域的单个位点上（如S249C）[2]。突变导致FGFR3蛋白分子间构象上形成异常的二硫键，这会导致分子的二聚化并激活受体，从而引起细胞行为的改变，诱发癌症。
检测蛋白与蛋白间的相互作用是揭示其在细胞进程和众多疾病中作用的关键所在。为了检测FGFR3突变体的二聚化，我们引入了Split-GFP系统，通过光学追踪的方式了解蛋白间的相互作用，可以很好地帮助研究人员阐明蛋白的调节机制，同时确定蛋白在疾病中的异常过程。蛋白片段互补分析（PCA，protein-fragment complementation assays）是一种基于断裂的绿色荧光蛋白（GFP）以及双分子荧光互补(BiFC，bimolecular fluorescence complementation)的色彩转变技术。BiFC依赖于诱饵蛋白和目标蛋白间的相互作用，这种作用可以将两种不产生荧光的蛋白结构域聚集到一起，并通过beta;-桶装结构将其折叠在一起从而产生荧光。因为GFP片段的聚集是不可逆的，保证了BiFC进行整合、积累以及检测短暂的相互作用和亲和力复合物的稳定性。这一作用力维持了相互作用的蛋白之间的联系，以便更好的追踪复合物[3-5]。通过这一系统，研究人员可以方便直观的检测细胞中的荧光含量并间接证明蛋白与蛋白间的相互作用。
- 研究目的
膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一，占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位。大约50%的膀胱癌患者都在FGFR3基因的编码序列上发生突变，并且大多数突变与激活种系突变导致的致死性软骨发育不全和致死性侏儒有关。突变导致的膀胱癌与非肌肉性型的侵袭性疾病有很强的联系，大约50-60%的非肌肉型侵袭性癌症与FGFR3突变有关，但是突变很少发生在肌肉型侵袭性膀胱癌上。EGFR基因激活的突变大多发生在激酶结构域上，与之相反的是，超过一半的FGFR3突变发生在胞外区域的单个位点上（如S249C）。突变导致FGFR3蛋白分子间构象上形成异常的二硫键，这会导致分子的二聚化并激活受体，导致细胞内信号的异常传递，从而使细胞行为紊乱诱发癌症。根据膀胱癌的发病原因，我们决定探索突变型的FGFR3是否会自发形成二聚体，并给出其存在依据。
- 研究意义
探究膀胱癌的一种发病机制，更好的了解细胞信号转导在癌症的预防和治疗中的作用，为膀胱癌的治疗开辟新的视野和途径，提供一种新的靶细胞作用位点和治疗手段，为新药的研发提供新的思路。
- 文献综述
受体酪氨酸激酶（RTKs）家族中的FGFR家族有一个很重要的特点就是一系列FGFR的亚型都是由FGFR转录时的选择性拼接产生的。这四种传导信号的FGFR1-FGFR4都是由胞外的连接结构域、跨膜的单链结构域和包含蛋白酪氨酸激酶催化中心以及附加调节序列组成的胞内结构域所构成的。FGFR胞外的配体结合结构域是由三个类似于免疫球蛋白的结构域组成[6]，被称为D1-D3；D1和D2间通过7-8个酸性氨基酸的连接物连接而成，被称为“酸性盒子”，D2结构上的带有保守的正电荷，可以作为与肝素的结合区域。可溶性的分泌FGFR也是由于第三段免疫球蛋白样结构域的选择性拼接产生的，D3区域的连接位点的特异性改变有很深的影响。D3中的选择性拼接区位于FGFR1、2、3中，但不存在于FGFR4中。现已知的FGFR2基因编码D3区N端一半的氨基酸序列由7个外显子组成，而D3的C端一半的氨基酸序列由8-9个外显子编码，也因此分别被称为“b”或“c”型的FGFR。这两种不同的形式表现出不同的连接特性。FGFR2b亚型单独表达于上皮细胞，FGFR2c单独表达于间充质细胞。FGFRⅢb和FGFRⅢc连接点特异性的表达会引起上皮细胞和间充质细胞在发育过程中对不同的FGF产生不同的效应。
X射线晶体结构显示：因配体结合而被激活的二聚化的FGFR是通过FGF或受体与受体间直接相互作用来维持其稳定性的。这种相互作用就是肝素与两个FGFR二聚化后的D2结构域形成的带有正电荷的缝隙连接，也可以是两个直接连接的FGF分子。通过FGF与肝素的连接实验证实，配体间连接的亲和力可以通过细胞表达缺失D1和酸性盒的突变FGFR得以增强，相当于将完整地FGFR捆绑于细胞上。通过等离子共振连接实验可以得到类似的结论，FGFR的D2和D3结构域是与FGF的初级结合区域，D1和酸性盒有自发阻止结合功能。FGFR3基因的破坏会导致骨骼过度发育。FGFR的近膜区结构域比其他受体酪氨酸激酶的要长很多。这些区域包含高度保守的序列，例如磷酸酪氨酸结合域的结合位点。FGFR1/2/3与骨骼发育有关，FGFR3点突变会导致软骨发育不全和致死性的Ⅰ型和Ⅱ型发育不良。大多数人类侏儒症都是与FGFR3的跨膜区域获得性功能突变有关。生物学分析证实ACH突变提高了蛋白激酶的活性以及FGFR3突变蛋白的稳定性。现已证实FGFR3缺陷引起骨骼长度增长是由于软骨细胞肥大。每一种类型的突变都会在胞外结构域产生不对称的半胱氨酸，由此会形成分子间的二硫键。通过FGF/FGFR复合物的结构，研究人员发现突变不是直接增加半胱氨酸残基，许多突变位点在D3上，形成的分子间二硫键会减少D3结构的稳定性。FGFR3与许多人类的癌症有关，已经有很多实验阐明是FGFR3激酶引起的下游信号通路导致的细胞转化[7]。
- 待解决的问题
突变型的FGFR3是否会自发形成二聚体，通过何种实验手段或技术可以证明形成的二聚体确实真实存在。
- 研究方法
Split-GFP的折叠和自我聚集是一种新的检测蛋白与蛋白间相互作用的方式，通过这种研究方法我们对突变型FGFR3所形成的异常构象进行检测。若突变型的FGFR3分子间主动形成二聚体结构，通过Split-GFP系统所产生的荧光即可方便直观地表现出来，从而间接找出因为FGFR3突变而导致癌症的原因。
- 实验方案
1.克隆Human FGFR3野生型（WT）以及248、249位点半胱氨酸突变体的基因。
2.构建FGFR3-WT、FGFR3-R249C和FGFR3-S249C分别融合hGFP 1-10 OPT 和S11 M3的真核表达载体。
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