hTfR1多抗制备及其脑靶向作用的研究
一、[课题研究的主要目的和意义]
血脑屏障的存在，使98%以上的中枢神经系统疾病治疗药物无法进入脑中发挥作用。但是，在脑毛细血管内皮细胞上存在特定的受体转运机制，如肿瘤组织细胞膜上存在多种特异性受体，如转铁蛋白受体（TfR）、胰岛素受体、叶酸受体、低密度脂蛋白受体、尿酸激酶受体、肿瘤坏死因子受体家族和超家族等，我们可以利用这种机制将药物运送到脑内。因hTfR通过与转铁蛋白的特异性结合来介导铁的转运，与细胞的生长、增殖、分化有密切的联系， 于是构建了pET32a(c )-hTfR1高表达质粒，转染至Ecoli细胞表达、纯化制得hTfR1。将表达纯化得到的hTfR1免疫兔子，进行hTfR1多抗的制备。在此我们的目的是构建一个以转铁蛋白受体为介导的跨血脑屏障的转运载体系统。
人转铁蛋白受体（human transferrin receptor,hTfR）是一种广泛分布于细胞膜上的跨膜糖蛋白（其结构示意图见图一）。hTfR是一种在细胞膜表面表达生成的两个单体通过89位和98位的半胱氨酸通过二硫键连接形成的同源二聚体，TfR主要由胞内结构域、跨膜结构域和较大的胞外结构域组成，在104位的苏氨酸上有一个O连接的糖基化位点且在251、317、727位的精氨酸残基上有3个N连接的糖基化位点，其胞外域有三个子域可与相对应的配体结合。
近年来，化疗已经成为癌症治疗的必要手段。然而，细胞毒性试剂对肿瘤细胞缺少特异性，导致严重的副反应。抗体-药物偶联物（ADCs）也被称为免疫偶联物（其作用机制见图2），属于靶向抗癌药的一种。在此我们制得hTfR1多抗-MTX偶联物并进行细胞毒性、脑靶向性、稳定性和活性的研究。
二、[拟研究或解决的问题]
1. 建立 hTfR1多抗纯化方法；
2. 研究荧光标记多抗的方法；
3. 初步探索脑靶向给药方法，并进行定性、定量研究。
三、[采用的研究手段]
1 A蛋白亲和层析法纯化动物血清抗体
1.1材料
免疫兔子得到的抗血清、Hitrap Protein-A Sepharose Affinity Columns
紫外分光光度计；电泳仪和电泳槽；酶联免疫测定仪
1.2方法
1.2.1 抗体过柱纯化
Protein A QZT 4FF广泛用于各种抗体的分离纯化。层析操作通常包括装柱、平衡、进料、淋洗、洗脱、再生等步骤。
平衡：用5~10CV的平衡缓冲液（20 mM PBS 0.15M NaCl，pH 7.0，添加适当浓度的NaCl抑制非特异性吸附）平衡层析柱，至流出液电导和pH不变（与平衡液一致）。
进料：用平衡液对样品进行溶解稀释。
淋洗：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。
洗脱：用洗脱缓冲液（20 mM柠檬酸，pH 3.0-4.0；或0.1M甘氨酸，pH 3.0；或20 mM乙酸钠，pH 3.0-4.0）洗脱，收集流出液。洗脱后，应立刻用碱性缓冲液（如1M Tris/HCl, pH 9.0）将收集到的抗体溶液中和到抗体稳定的pH，避免抗体失活，维持抗体的生物活性。
1.2.2 抗体纯度鉴定：因为抗体的相对分子质量约为150000，通过SDS-PAGE与Marker对比即可判定抗体纯度。
1.2.3 抗体浓度测定：用BCA测蛋白含量。
2 荧光标记多抗
2.1材料
纯化后的hTfR1多抗、FITC（异硫氰酸荧光素）
2.2方法
（1）将待交联的蛋白（浓度1mg/mL）对交联反应液透析三次 4℃，至 pH＝9.0。交联反应液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至 1 L。
（2）将 FITC 溶于 DMSO 中，浓度为 1mg/mL。每次交联使用的 FITC 均应新鲜配制，避光。
（3）按 P:F（蛋白质:FITC）=1mg:150mu;g 的比例将 FITC 缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处 4℃反应 8h。
（4）加入 5mol/L 的 NH4Cl 至终浓度 50mmol/L，4℃终止反应 2h。
（5）将交联物在 PBS 中透析四次以上，至透析液清亮。
（6）交联物的鉴定
蛋白浓度(mg/mL) = [ A280 0.31A495 ] / 1.4
F/P 比例: 3.1A495 / [A280 0.31A495 ]，该值应介于 2.5～6.5 之间。
（7）FITC 交联的蛋白应置于 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液中，加入 0.1% NaN3、1% BSA，4℃避光保存。
2.3 将荧光标记后的多抗通过小鼠腹腔注射给药，之后做冰冻切片于荧光显微镜下观察多抗在小鼠体内分布情况。
3 脑靶向给药方法研究
目前我们使用的是脑靶向给药的生物方法，即利用抗体技术将药物与能够通过BBB的肽或者蛋白相偶联，然后利用BBB上载体的转运作用（即转铁蛋白受体介导的运输系统），将治疗药物运输到中枢神经系统，从而达到治疗的目的。
药物脑内靶向技术可以分为3类:第1类是侵入损伤性的给药方法,它包括高渗休克、颈动脉注射血管活性物质和直接脑室注射给药。这些方法虽然有效,但是可能造成脑部感染、BBB的损伤以及外科性损伤。第2类方法是增加药物透过BBB的方法,其中酯化(lipidization)和化学传递系统(chemical delivery systems,CDS)均对药物本身的理化性质提出了很高的要求,具有较大的局限性。载体介导转运能够增加药物的脑内摄取,但是体内内源性的营养物质会与其竞争结合载体,而使两者的摄取均受到限制。吸附介导的转运系统中的阳离子白蛋白可能在血液中不稳定,且可能具有免疫原性。受体介导的胞吞转运的载体,如hTfR多抗因其相对应的靶目标hTfR分布具有较高的脑内特异性,而使得脑靶向作用明显,可以介导药物入脑。
四、[参考文献]
【1】 邓瑞春, 张明伟. A 蛋白亲和层析法纯化动物血清抗体的效果比较[J]. 氨基酸和生物资源, 1999, 21(1): 7-9.
【2】 孙玉, 于菲, 孙柏旺. 靶向癌症治疗试剂抗体-药物偶联物 (英文)[J]. 药学学报, 2009, 9: 005.
【3】 赵相国, 陈国广. 脑靶向给药的主要方式及其应用[J]. 中国新药杂志, 2003, 12(2): 93-97.
【4】 陆伟, 蒋新国. 脑内靶向给药研究进展[J]. 中国临床药学杂志, 2002, 11(6): 384-387.
【5】 王燕, 孙燕. 肿瘤靶向治疗现状和发展前景[J]. 中华肿瘤杂志, 2006, 27(10):638-640.
【6】 Daniels T R, Delgado T, Rodriguez J A, et al. The transferrin receptor part I: Biology and targeting with cytotoxic antibodies for the treatment of cancer[J]. Clinical Immunology, 2006, 121(2): 144-158.
hTfR1多抗制备及其脑靶向作用的研究
一、[课题研究的主要目的和意义]
血脑屏障的存在，使98%以上的中枢神经系统疾病治疗药物无法进入脑中发挥作用。但是，在脑毛细血管内皮细胞上存在特定的受体转运机制，如肿瘤组织细胞膜上存在多种特异性受体，如转铁蛋白受体（TfR）、胰岛素受体、叶酸受体、低密度脂蛋白受体、尿酸激酶受体、肿瘤坏死因子受体家族和超家族等，我们可以利用这种机制将药物运送到脑内。因hTfR通过与转铁蛋白的特异性结合来介导铁的转运，与细胞的生长、增殖、分化有密切的联系， 于是构建了pET32a(c )-hTfR1高表达质粒，转染至Ecoli细胞表达、纯化制得hTfR1。将表达纯化得到的hTfR1免疫兔子，进行hTfR1多抗的制备。在此我们的目的是构建一个以转铁蛋白受体为介导的跨血脑屏障的转运载体系统。
人转铁蛋白受体（human transferrin receptor,hTfR）是一种广泛分布于细胞膜上的跨膜糖蛋白（其结构示意图见图一）。hTfR是一种在细胞膜表面表达生成的两个单体通过89位和98位的半胱氨酸通过二硫键连接形成的同源二聚体，TfR主要由胞内结构域、跨膜结构域和较大的胞外结构域组成，在104位的苏氨酸上有一个O连接的糖基化位点且在251、317、727位的精氨酸残基上有3个N连接的糖基化位点，其胞外域有三个子域可与相对应的配体结合。
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