一、课题的研究背景、意义和目的
近年来，心脑血管疾病已超过肿瘤，成为我国发病率和死亡率第一位的疾病，而动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)正是其病理基础。由于As所引起的心脑血管疾病是一种严重危害人类健康的常见病和多发病，并且其发病机制尚未完全清楚，临床也无有效的药物根治。但根据氧化—损伤学说，As是血管内的一种炎症性病变，近年来该病的发病率在我国逐渐增多，成为老年人死亡主要原因之一，因此研究抗As的药物具有特别重要的意义。我们开发了一种新型双功能分子（GAD），它的组成是用一段柔性的连接肽将胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和球状脂联素（gAd）连接起来，主要用于预防和治疗糖尿病并发的动脉粥样硬化。
据文献查证，一氧化氮（NO）是内皮细胞产生最重要的舒血管因子，由内皮细胞的NO合酶（eNOs）作用于L-精氨酸产生，NO可扩散至血管壁平滑肌细胞激活鸟氨酸环化酶，介导cGMP调控的血管舒张。不仅如此，NO还具有抑制血小板聚集、抑制单核细胞粘附于内皮细胞、抑制平滑肌细胞增殖等作用。然而血管内皮在受到一系列有害因素作用时，内皮细胞释放的舒血管因子减少，缩血管因子增多，打破血管平衡稳态，最终导致一系列心血管事件的发生。
GLP-1可作用于胰岛beta;细胞，促进胰岛素基因的转录、胰岛素的合成和分泌并可刺激胰岛beta;细胞的增殖和分化，抑制胰岛beta;细胞凋亡，增加胰岛beta;细胞数量。此外，GLP-1还可作用于胰岛alpha;细胞，强烈地抑制胰高血糖素的释放，并作用于胰岛delta;细胞，促进生长抑素的分泌，生长抑素又可作为旁分泌激素参与抑制胰高血糖素的分泌。研究证明，GLP-1可通过多种机制明显地改善2型糖尿病动物模型或患者的血糖情况，其中促进胰岛beta;细胞的再生和修复，增加胰岛beta;细胞数量的作用尤为显著，因此可有效的降低体内高糖水平。而据文献查证，体内高糖水平与内皮细胞病变可能存在关联。
有科学家发现脂联素可以降低单核细胞的粘附作用，单核细胞可以使THP-1细胞在人体大动脉内皮组织排列成行，而这种粘附作用发生在动脉粥样硬化血管壁损伤的早期。脂联素还可以降低多种粘附分子在内皮细胞的表达。据报道,脂联素可能通过抑制NF-kappa;B的信号通路调节内皮细胞的功能。
另有文献报道，GLP-1和gAd都可以激活内生性NO合酶(eNOs)，从而增加体内NO的水平。因此，本实验主要探讨GAD可能通过PKA、PI3K/Akt通路作用于eNOs，从而促进NO的生成，加强对内皮细胞的保护作用，降低动脉粥样硬化症产生的可能性。
二、课题研究的主要内容
1. GAD蛋白的纯化
1.1 探索优化pH、温度、转速、洗脱条件等。
1.2 使用饱和（NH4）2SO4溶液提取后，过镍柱后测SDS-PAGE，与此同时可进行BCA的定量测定，然后浓缩到需要的浓度。
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