一.研究内容1. 本次试验主要在于寻找具有靶向性、低毒性和缓释、适合作为抗癌药药递送系统的多肽水凝胶，评价其作为载药递送系统时药物在体内的释药能力和对肿瘤细胞疗效。水凝胶是一种细丝交织而成的网状结构，亲水性和疏水性氨基酸交替形成的分子肽。1-1 根据文献报道，PH敏感的八肽分别由赖氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和谷氨酸合成，苯丙氨酸可用于改变八肽的整体疏水性，基于苯丙氨酸的肽可形成beta;-折叠结构，在中性条件时形成水凝胶，酸性条件下自组装会破裂，形成溶胶。因此，pH响应性多肽水凝胶作为抗癌药递送系统时，可在正常组织细胞内停留少，减少药物毒性。定向在肿瘤细胞内停留，实现药物的靶向性。1-2 凝胶在体内降解时只形成氨基酸，对机体不会产生不良影响；当导入人体之后，不会引起免疫反应和组织炎症。且根据体外细胞毒性研究，MTT分析报告确定多肽水凝胶在不同浓度下的细胞毒性，确定最适浓度，进一步降低多肽水凝胶对机体的伤害。二.实验材料2-1 用料： 本次实验拟采用紫杉醇、鼠类H22肝癌细胞系、水凝胶多肽、胎牛血清、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、生理盐水等。2-2 动物：生长在自然光照/黑暗条件下于25℃盒45%-65%湿度条件下饲养的小鼠（18-20g），且符合中国药科大学伦理委员会批准。三.研究手段3-1 pH响应性多肽水凝胶的性质研究3-1-1：此次试验中，使用标准固态合成程序合成FER-8肽，根据以往文献进行纯化，包括使用Pink树脂做载体、采用Fmoc保护策略、通过反向高效液相色谱法分离纯化。3-1-2：完成肽的分离纯化后，下一步进行肽的自组装，初步完成水凝胶肽自组装的评估。包括：①使溶液形成水凝胶30分钟后，将水凝胶转移到透明小瓶中，将小瓶外翻，观察在5-8每个不同PH下水凝胶的流动、溶胶和凝胶互变的过程，记录下互变时的PH值。②采用单一变量法，水凝胶最适浓度下加入不同浓度的抗癌药物，静置30分钟，观察并记录水凝胶的形成和沉淀，以确定水凝剂的最佳负载能力。③ 使用Eppendorf管法进行药物释放实验。
3-1-3： 使用体外细胞实验法，评价在最适水凝胶浓度和最佳药物浓度条件下，抗癌药物系统对正常细胞的毒性。
3-2 pH响应性多肽水凝胶抗肿瘤评价3-2-1 ：用具有H22细胞的小鼠（18-20g）作为抗肿瘤实验的评价。主要有：① 使用H22 细胞悬浮液皮下注射到小鼠左边肢，进行培养，当肿瘤长到一定体积后，将小鼠随机分为3组，分别为：生理盐水组，紫杉醇组，HG-PTX；培养12天，分别在3天的倍数时测量肿瘤体积，来评价毒性和抗肿瘤功效。四.文献综述
pH响应性多肽水凝胶的合成和载药性质研究摘要：以原始肽C-末端一段序列为基础，采用Fmoc固相合成法合成八肽FEFEFRFK（简称 FER-8）；采用自组装的方法制备PH-响应性多肽水凝胶，用透射电镜(TEM) 和扫描电镜(SEM) 等研究其性质。关键词：自组装、水凝胶、靶向性
1.背景根据世界卫生组织的研究，癌症是目前对全人类健康死亡具有严重威胁的疾病之一。肿瘤细胞中，细胞凋亡相关的信号通路产生障碍，因此癌细胞具有不死性，除此之外，还具有迁移性和失去抑制接触。目前，已经开发了纳米颗粒和囊泡等作为载体靶向治疗癌症，但观察到具有局限性、抗性等。据文献了解到，PH响应性多肽水凝胶在中性环境时自组装形成水凝胶，并具有高载药量。在偏酸性的微环境中，自组装会破裂，从凝胶变成溶胶。肿瘤细胞微环境的PH值比正常细胞微环境低，因此pH响应性多肽水凝胶可在肿瘤细胞定向破裂，增加药物治疗特异性。2.多肽优点多肽自组装水凝胶具有良好的生物相容性。多肽是人体的重要组成部分，其自组装通过非共价作用进行，不需要添加任何其他化学交联剂，可以很好地适应生物体，无毒副作用；多肽水凝胶能够包裹大量水分，可以作为药物输送载体。因此可用于研究抗癌药物递送系统。
3. 试验方法1. 多肽合成及鉴定配制一定浓度的多肽水溶液，将装有多肽溶液的小瓶置于装有氨水的小烧杯中，随着氨水的挥发，达到多肽成胶的 pH 值时多肽溶液形成支撑性水凝胶。鉴定：① 用透射电镜观察水凝胶形态。② 扫描电镜(SEM)观察③ 通过圆二色谱(CD)观察多肽二级结构变化2. 多肽载药性和释药能力①FER-8水凝胶的载药量，根据文献记载紫杉醇可选作抗肿瘤药物。在乙腈溶剂中制备浓度分别为5、7、9mg/ml的不同药物溶液，分别放于八肽水凝胶中，静置30分钟，观察并记录水凝胶的形成和沉淀，以研究水凝胶的负载能力。② 使用Eppendorf管法进行药物释放实验，将药物加入到装有FER-8肽的水凝胶中，在37℃条件下观察6天，在不同的时间间隔内，从释放介质中取出样品进行药物含量分析，以此为不同数据点，做药物在体内的释放曲线。结论： 多肽水凝胶受多种环境影响，如温度、溶剂、PH等。因为肿瘤细胞微环境的PH值比正常细胞微环境低，所以可设计PH敏感的多肽水凝胶用于治疗癌症，在文献报道中，已经设计出了具有载药量高，释放时间长的水凝胶药物递送系统，故将水凝胶用作抗癌药的载体，可明显提高药物靶向性，减少药物服用频率，降低药物对正常细胞毒性。这类研究目前处于初期阶段，相信在源源不断科研人员的努力下，将会寻找到最适合于抗癌药物的载体，为人类健康消除一大重要隐患。参考文献：
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