课题名称：胆汁酸代谢酶在雷公藤甲素所致肝毒性中的表达
研究问题：雷公藤甲素的主要作用机制
胆汁酸代谢酶水平与雷公藤诱导肝毒性的关系探究
抗原呈递细胞的选择性表达与雷公藤甲素的关系
拟研究手段：HCA检测肝细胞毒性与TP的c-t曲线；基于定量蛋白质组学理论的同时采用靶向脂质组学的方式分析抗原呈递细胞的选择性表达；
文献综述：采用基于高内涵分析(High Content Analysis, HCA)的细胞表型分析技术，通过系统检测TP诱发肝细胞毒性(包括氧化还原系统损伤、DNA修复、线粒体膜电位降低等)和细胞应激反应(氧化应激、内质网应激、缺氧应激、DNA损伤应激、细胞自噬等)表型谱的时间和浓度依赖关系的改变，寻找TP诱发肝毒性的特异性事件;结合TP抗肿瘤分子靶的调控机制，采用定量PCR和细胞免疫定量分析技术，在肝细胞上确证了具有因果关系的致TP肝毒性起始和核心事件;在此基础上，以原代、传代肝细胞及大鼠为研究对象，综合应用体外细胞三明治培养，荧光素酶EGFR报告系统，代谢酶活性测定及代谢产物HPLC/MS鉴定等技术，考察TP对核因子孕烷X受体 C PXR)及其靶基因，特别是代谢酶CYP3A4基因的调控作用，并验证TP通过抑制CYP3 A4表达、增加抑制底物药物阿托法他汀(Atorvastatin, Auto )和自身的代谢解毒，协同产生肝毒性作用。介质1中制备肝线粒体，重悬液更换为介质2，差速离心后使用重悬液洗涤三次。荧光探针罗丹明123为线粒体跨膜电位指示剂，荧光分光法测定线粒体跨膜电位变化。加入阳性对照药CCCP及TP预计均呈浓度依赖性膜电位下降。分光光度法线粒体膜通透性转变(MPT)检测中加入阳性对照药CsA可以抑制线粒度肿胀并观察了TP的作用。新鲜制备的昆明小鼠肝脏线粒体与，TP(终浓度0,2,4,8,10Wg·ml一rsquo;)于3790孵育30 min。线粒体与胞浆蛋白经12%分离胶电泳，转印后一抗(purified Mouse Anti-Cy-tochromeC , I : 50 )孵育4小时，二抗(Goat Anti Mouse , I ; 3000 )孵育2小时。进而表明肝线粒体是TP肝毒性作用中主要靶点。
基于定量蛋白质组学,分析了BALB/c小鼠给予高剂量雷公藤甲素（900mu;g/kg）后,不同时间点（0h,1h,2h,8h）肝脏以及肾脏中蛋白的动态变化。并采用靶向脂质组学的方式分析了了0h,0.5h,1h,2h,8h,24h肝脏和肾脏中脂肪酸的变化情况。我们发现给予雷公藤甲素后,肝脏、肾脏分别鉴定到271、227种差异蛋白。其中肝脏中显著变化蛋白影响的通路主要有急性时相反应,抗原递呈,FXR/RXR通路激活等,影响的分子生物学功能有脂代谢,小分子代谢等。主要影响的脂质相关功能有Fatty acid metabolism,conversion of polyunsaturated fatty acids, oxidation of lipid和hydroxylation of lipid。肾脏中显著变化蛋白参与调节的通路有EIF2通路,急性时相反应等,影响的分子细胞功能主要有脂质代谢。主要影响的脂肪酸相关生物学功能有oxidation of fatty acid, fatty acid metabolism, beta oxidation of fatty acid。在靶向分析的36种脂肪酸中,肝脏中有24种脂肪酸变化显著,包括C17:0, C18:0, C18:2, C18:3, C20:0, C20:3, C20:4等。肾脏中显著变化脂肪酸的有12种,包括C12:0, C12:1, C14:0, C14:1, C16:1等。通过生物信息学软件IPA分析,我们发现肝脏、肾脏中脂肪酸的变化与蛋白质通路的调节相互印证
每天在固定时间给C_57小鼠灌胃配好的TP溶液，持续三周;在第7天、第14天和第21天按照动物伦理学方法处死C_57小鼠，每次处死6-7只C_57小鼠。通过HE染色肝脏组织观察TP对不同时期TP诱导的肝损伤C_57小鼠肝脏的病理变化;用专业试剂盒分析血清中ALT和AST的活性;再通过试剂盒来进一步分析肝脏组织中CAT, SOD, GSH和MDA的水平;通过蛋白免疫印迹法分析C_57小鼠组织中CYP2E1, IL-6, TNF-a和P-NF-oB蛋白的表达;采用RT-PCR法来分析C_57小鼠肝脏组织中各mRNA的表达。体外细胞实验中，同样设置四组:正常组，TP组(20nm) ,TP CMZ (80}M), TP PZ (60}M)。将IHHA-1细胞给药培养12h后，通过MTT试剂盒分析TP对IHHA-1细胞活力的影响;在细胞的氧化应激实验中，以TP刺激12小时建立细胞体外肝毒性，用专业的ROS荧光探针IHHA-1细胞中ROS进行标记，用流式仪器准确分析经TP刺激后IHHA-1细胞中产生ROS的含量。按
照蛋白提取法提取蛋白，然后免疫印迹法分析CYP2E1, IL-6, TNF-a和P-NF-oB各蛋白的水平;采用RT-PCR法来定量分析IHHA-1细胞中CYP2E1, IL-6, TNF-a和P-NF-KB各mRNA的水平。
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