阳离子脂质体基因药物载体的制备与FRET处方探索文献综述

 2022-12-04 04:12
  1. 研究背景

小干扰RNA（Small interfering RNA；siRNA）又称为短干扰RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一个长20到25个核苷酸的双股RNA。siRNA 依赖于不同的蛋白质实现其功能，虽然它们的生物合成途径不同， 但是他们的作用机制大致相同。外源性或内源性的dsRNA 被导入细胞，接着dsRNA与Dicer 酶结合，dsRNA 则被切割为20到25对核酸序列的小片段［1］。siRNA其中的一条链与蛋白复合物结合并形成RNA诱导沉默复合物（RNA induced silencing complex,RISC） ，正义链离去，同时在ATP的作用下，反义链通过碱基互补配对原则，与mRNA结合。核酸内切酶的作用下，mRNA被切断［2］。mRNA上从启动子开始，每三个核苷酸组成一个基因，mRNA作为蛋白质合成的模板，一旦mRNA被剪切破坏，相应的蛋白也就无法合成，即基因沉默，控制相应蛋白的表达。治疗过程中，siRNA一方面使mRNA直接酶解，从而沉默基因；另一方面以siRNA为引物，mRNA为模板，形成mRNA的互补链，即双链RNA（dsRNA），可裂解成siRNA，进一步干扰基因表达。

对于体内运送siRNA的载体，目前有多种方案，总的分为病毒类载体和非病毒类载体。因病毒类载体有较明显的副作用和潜在的免疫原性，目前较少使用。非病毒类载体则因其安全性和有效性越来越受到关注［3］。非病毒类载体有如下几种：（1）阳离子多聚物如PEI等，能与siRNA通过静电吸附作用形成复合物, 并且能够有效防止核酸被核酸酶降解。（2）纳米粒如壳聚糖，壳聚糖没有毒副作用 ,并且具有生物黏附性和相容性。（3）胶束是一种自组装的纳米化胶体粒子,具有疏水性内核与亲水性外壳, 目前已成功应用于多种药物的递送中 。（4）阳离子脂质体，是具有类似生物膜结构的双分子小囊，也能产生静电吸附，与siRNA形成稳定的复合物［4］。这也正是本课题拟采用的递药方式。

脂质体是由磷脂、胆固醇和水包合形成的。磷脂在水中可以产生多层微囊,每一层都是脂质双分子层,层与层之间又被水相分隔 ,最后产生的这种多层微囊就是脂质体。按脂质体表面的电荷来分, 脂质体可分为中性脂质体、阴离子脂质体 、阳离子脂质体［5］。本课题将阳离子脂质体作为基因药物的载体 ,有如下的优点: 安全无毒，对人体不会产生副作用；制备简单，载药容量大；复合物稳定，易与细胞膜融合，基因转染利用率高［6］。

对于阳离子脂质体与siRNA复合物的稳定性，本课题拟采用能产生荧光共振转移的两个荧光探针分别标记脂质体和siRNA，根据其能量转移的效率来判定复合物的稳定性。荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）是指两个不同的荧光基团中，如果一个供体荧光基团的发射光谱与另一个受体基团的吸收光谱有一定的重叠，并且这两个基团的距离小于100nm时，此时供体发射波产生的能量能被受体吸收，从而产生激发光谱［7］。能量传递的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向，供体与受体之问的距离等都有关系。因此在供体和受体基团一定的条件下，可利用FRET效率来判定复合物距离的远近，从而判定复合物是否稳定［8］。

  1. 拟解决的问题

siRNA是一种重要的基因药物，但其自身存在很多缺陷，限制了它的用途，如siRNA本身很不稳定，易降解；其自身为亲水性，故难以穿透脂质的生物膜；siRNA表面带负电，很难进入表面也同样带负电的细胞膜；另外，还有可能产生脱靶效应等副作用。因此，我们要找到一个合适的载体，能克服上述的部分缺点，能够很好的与siRNA结合，准确的将siRNA递送到预定的部位。另外，siRNA与载体形成的复合物的稳定性很难表征出来，即复合物做出来之后，它的稳定性很难评价。

  1. 研究方法

针对siRNA的缺陷，我们想到用阳离子脂质体来弥补，阳离子脂质体的表面带正电，能与带负电的siRNA结合更加紧密［9］。阳离子脂质体与生物膜有很好的相容性，能将大部分的药物都准确无误的递送进细胞内。

对于复合物稳定性的表征，本课题拟采用荧光共振能量转移（FRET）的相关理论进行判定。阳离子脂质体上插入NBD-PE荧光探针，而siRNA则接上cy3荧光探针。当阳离子脂质体和siRNA形成复合物之后，可以用荧光分光光度计进行测量，通过FRET比值判断二者之间的距离，从而表征稳定性和完整性［10］。

  1. 参考文献
  2. Kim K，Lee Y S，Carthew R． Conversion of pre-RISC to holo-RISC by Ago- RISC during assembly of RNAi complexes［J］． RNA，2007，13(1): 22 – 29
  3. 赵晴 陈广洁siRNA在自身免疫病治疗中的研究进展, 《 现代免疫学》 2012年第32卷第6期：519-522
  4. 苏志会，张娜.小干扰RNA非病毒递送载体的研究进展.药物生物技术,2015 22(2):151 ～155

4.葛华, 王清清,宋海峰,付洁 , 王东援.siRNA 体内递送研究进展,中国新药杂志 2010年第 19卷第 12期 1031-1034

5.陈彦祥, 乔卫红, 刘栋良. 阳离子脂质体的转染机制及转染效率影响因素 . 生物工程学报, 2007, 23( 5) : 777- 780.

6.姚茂金. 阳性脂质体在基因治疗中的前景. 国外医学遗传学分册, 2006, 26( 5) : 152-154

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