开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
近年来，针对免疫检查点的癌症免疫治疗研究发展迅速，成为未来主流抗肿瘤研究的方向。
以提高肿瘤细胞免疫原性和对效应细胞的杀伤敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和效应分子输注宿主体内，协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长。免疫系统受共刺激分子和抑制分子即免疫检查点的双重调节，其中负向免疫检查点包括细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxxic T lymphocyte associated antigen 4 , CTLA4）/程序性死亡蛋白1（programmed death-1,PD-1）/T细胞蛋白激活抑制物免疫球蛋白可变结构域V-doman (immunoglobulin suppressor of T-cell activation, VISTA）可抑制T细胞杀伤肿瘤细胞肿瘤细胞的活性，阻断这些抑制信号即可提高抗癌免疫，最终达到消除肿瘤的目的。本实验主要通过结合VISTA亲和小分子的虚拟筛选结果，通过竞争性ELISA实验模型筛选出VISTA的抑制剂，并建立小鼠原代T细胞激活模型，以细胞炎症因子，和细胞增殖这两个指标来体外评价VISTA抑制剂的活性，
在临床应用方面，尚有一些问题有待解决：一是确定肿瘤中代表免疫检查点的生物标志物；二是个体化精准给药，肿瘤患者间存在着较大的个体差异，治疗时需要综合考虑肿瘤的特点与患者自身的特质而制定合理有效的治疗方案。
PD-1（Programmed death-1）是表达在T细胞表面的另一种重要的免疫抑制跨膜蛋白，为CD28超家族成员，其最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来，是现今最热门肿瘤免疫疗法免疫检查点抑制剂。PD-1有两个配体，PD-L1（又叫CD274或B7-H1）和PD-L2（又叫CD273或B7-DC）。肿瘤细胞可借助自身的PD-L1与免疫细胞的PD-1结合，欺骗免疫细胞使其误认肿瘤细胞为正常细胞，从而抑制识别攻击癌细胞的免疫系统，继续在体内繁殖，这成为免疫刹车机制。
德克萨斯大学MD安德森癌症中心领导的研究小组发现，与黑色素瘤相比，T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制剂（VISTA）优先在胰腺癌中高水平表达。研究人员的研究还提供了与黑色素瘤相比较的原发性和转移性胰腺癌免疫浸润的详细分析，这可能进一步有助于指导针对胰腺癌治疗的免疫治疗策略。对7个胰腺肿瘤样本的另一项分析发现，CD68阳性巨噬细胞具有不同的PD-L1和VISTA途径，分别起到抑制免疫应答的作用。对来自三名转移性胰腺癌患者的肿瘤的T细胞的研究表明，活性VISTA途径使肿瘤中的活性T细胞应答比PD-L1抑制更大程度地降低。这表明用PD-1 / PD-L1抑制治疗可能失败，因为未治疗的VISTA途径仍然抑制免疫应答。相反，阻断VISTA但不阻断PD-L1，抑制肿瘤浸润性T细胞产生细胞因子。VISTA、PD—l、CTLA4的信号通路是相互独立的。PD-1，VISTA，CTLA4和／或人淋巴细胞活化基因3蛋白 (humanLymphocyteactivationgene3protein，LAG3)的联合阻断在临床前期研究中都显示出协同作用。最近的一项临床试验联合使用伊匹单抗及nivolumab达到了40％的整体客观反应率,在最高剂量组达到53％E253。这提示了NCRs阻断抗体的联合应用时安全且临床有效的。
VISTA可抑制T细胞对肿瘤抗原的应答，Flies 等发现 VISTA可在CD4 T细胞上作为受体抑制CD4 T细胞的激活，而且它在T细胞和抗原提呈细胞( antigen presenting cells，APC) 上的共表达可增强它的抑制作用。与大多数的抑制性受体不同VISTA 在初始 T 细胞中即有很高的表达，可能在T细胞分化早期已抑制了T细胞的激活，而且VISTA在髓系和淋巴细胞中表达广泛。因此，VISTA 在人类疾病的治疗中有望成为新的目标靶点。
VISTA 来 源 自 National Center for Biotechnology Information 的数据库，具有跟已知的传递共刺激信号的分子具有相似的免疫球蛋白可变区( immunoglobulin variable region，Ig V) 。VISTA 胞外 Ig V 区与 PD-1 相似，因此 VISTA又 称 为 PD-1 同 源 物 ( D-1 homolo，PD-1H)在小鼠组织中，VISTA 主要表达在脾、胸腺、骨髓或有白细胞浸润的组织中(如肺)，在非造血组织中表达较弱(如心脏、肾和脑)。细胞水平上则在腹腔巨噬细胞、脾CD11b 单核细胞、CD11c 树突状细胞、CD4 T细胞和 CD8 T细胞上表达较高，在 B细胞上则表达较弱。因此本实验中选取小鼠脾脏作为T细胞提取器官，主要在CD4 T细胞中提取VISTA蛋白。
Lines 等发现 VISTA 具有免疫抑制和免疫调节的功能，可抑制T细胞分化为调节性T细胞( regulatory T cell，Treg) ，而且 VISTA 即使在脱离细胞培养环境下依然能使 T 细胞长期处于抑制状态。VISTA 可降低 IL-2的产生，低浓度 VISTA-Ig 的抑制作用 可 被 细 胞 因 子 白 细 胞 介 素 2 （interleukin 2，IL-2) 、IL-7 和 IL-15 拮抗，但这些细胞因子却不能拮抗超生理浓度的 VISTA-Ig 的抑制作用。他们认为VISTA 可能通过降低 T 细胞刺激信号来防止 T 细胞过度的激活。但是VISTA-Ig 并不会对 B 细胞的增殖产生影响。gamma; 干 扰 素( interferon gamma;，IFN-gamma;) 可通过上调经典主要组织相容性抗原复合体 Ⅰ ( major histocompatibility complexclass Ⅰ，MHC-Ⅰ) 类途径抑制抗肿瘤 T 细胞的应答，而 VISTA 敲除的小鼠 IFN-gamma;的产生增加，颗粒酶 B 和肿瘤坏死因子alpha;的产生减少，Wang 等猜想 VISTA 特异性抗体 Fc 段的参与进一步增强免疫反应，补偿 IFN-gamma;的作用。本实验中筛选化合物过程中利用IL-17、IFN-gamma;等抑制VISTA的作用使T细胞被激活，通过ELISA实验与待筛选的具有对VISTA抑制作用的亲和小分子化合物进行作用的对比，以评价该小分子化合物的抑制效果。
主要采用的研究手段是竞争性ELISA实验筛选 VISTA 蛋白的亲和分子，通过简单的共孵、洗涤和显色步骤即可表征筛选对象对于 VISTA 蛋白亲和力的高低。主要依靠辣根过氧化物酶与TMB 显色液反应发生颜色变化而进行检测。实验时将 VISTA 蛋白通过物理吸附作用包被在
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