一、实验背景
阿尔茨海默病（Alzheimers disease, AD）在临床上又被称为老年性痴呆症，以神经炎性斑、神经元死亡以及神经原纤维缠结为主要的特征[1]，多发于60岁以上的老人，是老年期常见的一类以慢性、进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的中枢神经系统退行性疾病。目前难以治愈，已成为继心血管疾病和肿瘤之后导致老年人死亡的第三大病因。
由于AD的发病机制至今尚未完全阐明，相关治疗药物研发进展缓慢，寻找和研究其有效治疗药物靶点成为当前医药科学研究领域的热点和难点。一直以来，在AD病理机制研究中，Abeta;淀粉样蛋白级联和tau 蛋白超磷酸化学说占据着主导地位，而近年来基于Abeta;和tau蛋白治疗靶点的药物研发在临床试验阶段却屡遭失败[2]，寻找靶向调节AD病理中更上游的因素，如脂质过氧化、铁死亡、神经元自噬、神经免疫炎症反应等可能是AD研究及其治疗药物研发的新策略[3-5]。
近年研究表明，与铁死亡相关的GPX4为靶点的谷胱甘肽氧化系统与AD病理进程密切相关[6, 7]。前期临床研究显示，与正常人相比，AD患者的脑皮质和海马区域均出现明显的铁沉积，且铁沉积与Abeta;斑块的分布共定位[8, 9]。AD动物模型研究发现，脑内铁含量的上调可加剧Abeta;的聚集、tau蛋白的过度磷酸化、病变脑区神经细胞的铁死亡进程，而使用铁螯合剂降低脑铁水平可明显改善与AD相关的Abeta;的聚集和tau蛋白的过度磷酸化等症状[10]。可以发现，AD病理的产生与铁死亡密切相关。前期调研发现：正常情况下，细胞内的过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）作为细胞内的主要解毒系统和抗氧化防御机制，可以防止由铁异常沉积造成的过度氧化应激；而在AD病理状态下，由于铁异常沉积造成该系统活性的显著降低，最终导致脂质过氧化引起神经元细胞铁死亡[11]。
中药仙茅为石蒜科植物仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）的干燥根茎，含有酚苷、木脂素和皂苷类成分。仙茅苷（Curculigoside）为仙茅的主要的酚苷类成分[12]，具有抗氧化、增强免疫、抗骨质疏松等多种生物活性[13]。由于仙茅苷的抗氧化以及有效升高血清中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（Catalase，CAT）的作用，目前仙茅苷作为中药治疗药物在骨质疏松[14]，类风湿关节炎[15]等疾病的相关性研究较多，在缺血性脑损伤[16]和抑郁症[17]等中枢神经系统疾病方面有少量的研究，而作为治疗药物改善AD的相关研究尚少。
目前以仙茅苷为主要成分的复方类药物在活血化瘀，清除氧自由基等方面已经具有十分显著的疗效。仙茅苷以老药新用的策略作为AD治疗药物可以有效避免药物无法透过血脑屏障，脑内血药浓度较低以及中枢给药患者耐受性差等AD相关药物研发中所遇到的瓶颈问题。仙茅苷作为中药单体，可以通过口服给药的方式治疗中枢神经系统性疾病，其具有结构和疗效明确，毒性远小于化学合成类药物等临床优势。前期文献调研发现：GPX4敲除小鼠认知和记忆能力出现了显著的下降，同时伴随着脑中与神经退行有关的蛋白（如NeuN，突触素，SNAP25）的显著下调以及与神经炎症（如GFAP，Iba-1）相关的蛋白的显著上调[17]。铁螯合剂能够显著改善P301S转基因AD小鼠的认知障碍，下调海马CA1区和齿状回铁离子蓄积的程度[18]。还有研究显示，体外给予仙茅苷可以显著增加细胞中硒元素的敏感性，并促进细胞中GPX4的转录水平，敲除GPX4可使仙茅苷抑制铁死亡的保护作用消失[19]。由文献调研结果推测：仙茅苷可能以GPX4作为AD治疗的药物靶点以抑制铁死亡的方式改善AD，且仙茅苷有望成为以老药新用为策略的新型AD治疗药物开展后续研发。
谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）是谷胱甘肽过氧化物酶中与铁死亡联系最密切的亚型，GPX4可将还原的谷胱甘肽（GSH）转化为氧化型谷胱甘肽（GSSG），从而将脂质氢过氧化物还原为相应的醇，或将游离的过氧化氢还原为水[20]。正常生理状态下，细胞内的过氧化氢酶和GPX发挥细胞内主要解毒和抗氧化防御功能，可防止由铁异常沉积造成的过度氧化应激；在AD病理状态下，铁异常沉积导致胱氨酸-谷氨酸转运受体System Xc-的表达显著下调，引起System Xc-下游GSH含量的下降和GPX4活性的显著降低，最终导致脂质过氧化引起神经元细胞铁死亡[11]。硒（Se）元素可通过转录因子TFAP2c和Sp1的协同上调GPX4的转录从而起到保护神经元的作用[21]。另有研究显示，铁死亡也被描述为一种自噬性细胞死亡过程，与自噬相关的蛋白可通过调节细胞内铁稳态和活性氧产生，在诱导铁死亡发生过程中发挥核心作用[22]。Beclin-1的磷酸化可通过与构成System Xc-的十二次跨膜转运蛋白SLC7A11直接相互作用，诱导脂质过氧化并通过阻断System Xc-的活性来促进铁死亡[23]。而且，Beclin-1是一种乙酰化蛋白，加入去乙酰化抑制剂后，Beclin 1在K430、K437这两个位点乙酰化水平显著增加，且乙酰化转移酶p300能特异性增加Beclin 1乙酰化，去乙酰化酶SIRT1能特异性促进Beclin 1去乙酰化[24]。由此推测Beclin-1乙酰化在与AD相关的铁死亡进程中发挥十分重要的作用，Beclin-1可能以自身磷酸化的方式促进乙酰化，通过诱导下游脂质过氧化的方式来促进细胞铁死亡的发生与发展进而加速AD的病理进程。FtMt是一种定位于线粒体内的铁储存蛋白，FtMt通过结合线粒体的游离铁，调节细胞质和线粒体之间的铁分布，降低胞质中的铁含量、减少ROS 生成。AD患者脑皮层区，FtMt mRNA水平和蛋白质水平均显著升高。有研究显示，FtMt过表达可通过调节细胞内铁水平，对Erastin 诱导的铁死亡以及Abeta;的细胞毒性进行有效的抑制从而保护神经细胞[25]。因此，线粒体中FtMt的表达水平也与AD相关的铁死亡病理进程存在着十分紧密的联系。
基于前期调研，本项目选取中药单体仙茅苷为工具药，侧脑室注射Abeta;1-42制造AD动物模型，采用生物信息学筛选差异基因，行为学实验检测认知功能的改善，Western blot和ELISA检测与AD与铁死亡相关的蛋白表达，为阐明仙茅苷调节经由调节GPX4靶点通路在AD发病和治疗中的作用和机制以及寻找AD 新的治疗药物靶点和治疗策略提供实验依据和新思路。
二、实验目的和意义
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