- 研究的问题
环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物，利用一种链置换DNA 聚合酶在等温条件(63 ℃左右) 保温30到60分钟，不需要升降温过程，一台加热器即可完成核酸扩增反应。与基于模板热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程的PCR相比，LAMP作为一种全新的核酸扩增技术，在灵敏度、特异性和检测范围等指标上优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PC，并且检测核酸成分比检测微生物本身危险性小。主要应用于细菌、病毒、真菌类微生物的检测，本课题根据对白色念球菌核酸序列的现有研究成果，在全面考察白色念球菌核酸靶序列的情况下，确定靶序列6个区域，进而设计该区域的4种特异性引物，最后通过实验证实该技术快速检测白色念球菌的有效性和合理性。
- 采用的研究手段
前期文献研究：通过图书馆、电子资源数据库等途径对文献进行调研，理解环介导等温扩增技术与细菌检测表征参数等相关知识，理清环介导等温扩增技术检测细菌有关理论及研究现状，获取白色念球菌核酸靶序列等相关数据信息，为设计针对靶序列6个区域的4种特异性引物提供思路和参照。
后期实验研究：
1.检测靶点筛选与引物设计
通过BLAST程序将已公布的白色念球菌全基因组序列基因与其他已知基因进行比对,利用比较基因组学方法筛选特异基因，通过在线软件(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计LAMP引物组。
环介导等温扩增引物设计
- 反应体系的建立
采用25 mu;L反应体系,分别对Bst酶、Mg2 、dNTPs、内引物、反应温度、反应时间进行单因素优化。
3.反应产物鉴定
扩增产物使用BstB I消化,在20 mu;L体系中加入5 mu;L 的LAMP产物、1 mu;L BstBⅠ、2 mu;L 10times;L Buffer,37 ℃酶切3 h。同时,以BamHⅠ为对照。酶切产物使用2%凝胶电泳分析,产物回收测序后经BLAST验证。
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