一种新型的甲基异构酶晶体结构测定与催化机理研究
一、课题研究问题及意义
随着人们对化学合成药物的研发成本高、筛选命中率低、研发周期长及毒副作用大等缺陷的认识逐渐加深，许多研究者都开始更多地从天然产物中寻求新药。天然产物是自然界广泛分布的动物、植物和微生物在生命周期内不断合成的一系列化合物及代谢产物。经过上亿年的进化，生物体产生的天然产物在化学结构和生物活性方面都体现出丰富的复杂性和多样性，更重要的是，长期的自然选择还赋予了天然产物对特定靶点专一的识别和结合能力。据统计，在1981年至2010年获批的药物中，虽然形式上67％的药物都是合成得到，但是其中17％的药物与天然产物具有一样的药效团，13％的药物是模仿天然产物抑制剂并与天然产物抑制剂具有相似的活性。如此看来，真正源于合成的药物仅占37％。
在种类繁多的天然产物中，生物碱类化合物分布广泛，结构复杂多样且新颖多变，也是成药率最高的天然产物之一。大部分生物碱类化合物由植物产生，微生物界以真菌产生的生物碱最多，但也有部分产生于放线菌，如丝裂霉素、链黑霉素和蝴蝶霉素等，它们均具有较好的抗肿瘤活性。然而，这些生物碱含量较少，复杂而独特的结构更是极大地增加了合成的难度，也成为限制其发展为药物的重要因素。伴随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学的不断扩展，一系列的生物化学研究为我们深入了解微生物源生物碱的生物合成机制，丰富酶催化的反应理论以及包括植物源在内的生物碱的生物合成提供了很好的实际借鉴和理论基础。
Maremycins是一类提取自海洋链霉菌属B9173的哌嗪二酮生物碱，我们的合作者通过基因组扫描和抗性基因筛选等技术，已经确定了其生物合成基因簇，并采用一系列选择性基因突变失活、中间体的化学结构分析、前体化合物喂养及关键步骤的生物化学研究技术，推测出一条合理的生物合成途径。本次课题的实验对象就是该生物合成途径中的甲基异构酶MarH。目前已有的研究揭示了该酶通过与MarI和MarG的协同作用，参与合成Maremycins的前体，并发现其还具备酰基转移的功能。但是，MarH的三维结构未知，其如何行使两种完全不同的功能尚不清楚。本课题的研究工作就基于此展开，我们计划通过蛋白晶体学的方法对MarH的结构进行研究，通过制备蛋白质单晶和定点突变的方法来阐明其催化机制。
二、研究手段
克隆、表达目的蛋白MarH：PCR、酶切、连接和转化
蛋白小量诱导表达
蛋白大量诱导表达
分离纯化MarH蛋白： 破菌离心
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