一、简介
近年来，由于纳米药物的低毒、高效等优良特点，以纳米技术为依托的纳米医学逐渐获得了人们的关注。其中，纳米材料作为药物递送载体，为药物递送方式多样化和提高药物治疗效率等提供了可能[1]。纳米级递送系统由于其药物可控、靶向的释放，全身细胞毒性的降低和药物副作用的减少而在各种疾病治疗中具有广泛应用[2]。
相较于其他递送载体，生物衍生材料以其良好的生物相容性以及大规模合成的可行性逐渐走进人们的视线。细胞外囊泡（Extracellular vesicles, EVs）是细胞分泌到细胞外空间的脂质结合小泡。根据生物发生、释放途径、大小、含量和功能，将EVs分为三个亚型，包括微囊泡、凋亡小体和外泌体[3]。其中由细胞质膜直接出芽形成的微囊泡，其大小在100-500 nm之间；凋亡小体，即细胞凋亡时产生的囊泡，粒径可以达到2 mu;m；而外泌体与前述两者有着明显的不同，具有鲜明的特点和独特的优势。其生物发生过程起源于晚期核内体，可以认为是活细胞经过“内吞—融合—外排”等一系列过程调控而形成的双层膜性囊泡[4]。作为释放到细胞外环境的纳米级磷脂双层囊泡，外泌体的直径范围一般为30-150 nm[5]，密度在1.13-1.19 g/mL之间[6]，外形为杯托状或盘状[7]。它们天然存在于大多数体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳等，内部搭载着多种蛋白质、RNA、DNA等重要生物信号物质[8]，通过在细胞与细胞之间转移这些生物分子的方式，发挥着物质和信息传递的重要作用，也因此与许多生物过程密切相关。例如能够调节宿主-病原体的相互作用，参与炎症、神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程[9]，同时在人正常的生理过程如生长发育、血管生成和免疫反应等方面也发挥着搭建细胞间通讯桥梁的重要作用[10]。2013年，诺贝尔生理学或医学奖颁给在细胞间囊泡运输调控机制领域作出突出贡献的科学家，将外泌体研究的热度推向高潮。在短短几年时间里，外泌体作为一种递送药物安全有效的解决方案，以及再生医学的新工具，已经开始得到认可。目前，国内外针对外泌体的研究主要集中在细胞生物学、生物化学与分子生物学、遗传学和肿瘤学等领域。
外泌体相较其他药物递送载体所具有的众多优势，使它成为了未来个体化治疗中被人们寄予厚望的一种药物载体。由于目前尚未开发出人工外泌体合成方法，因此我们急需开发一种安全且有效的方法来从天然来源获取外泌体。迄今为止，研究者们已陆续从人、牛、猪、袋鼠、骆驼、老鼠、马以及熊猫等动物的乳汁中分离出外泌体[11]。其中，存在于牛奶中的外泌体，不仅含量丰富，而且包含脂质、微小RNA、蛋白质、mRNA以及DNA等生物分子。牛奶，不仅是目前最容易以较低成本大量获得的一种天然来源，而且即便在经过巴氏消毒后[12]，牛奶外泌体（Milk-exosomes，M-exo）仍然具有完整的膜结构，揭示了M-exo的良好稳定性和完整性。利用M-exo所搭建的口服药物递送平台具有诸多优势，首先，外泌体的来源是成本低廉且量大易得的牛奶，为我们获得充足的M-exo提供了物质保障；其次，由于其来自于日常食用的饮品，其生物安全性可以得到保证[13]。再者，已经有研究证明M-exo即便是在胃液的强酸和多种蛋白酶的作用条件下也能够不被破坏，进入肠道后外泌体依然可以保持其完整性，其穿越胃肠道屏障的能力赋予了它们发展为一种口服递送平台的潜能[14]。除上述优点之外，通过文献调研以及前期预实验摸索，我们发现M-exo被小鼠口服后，相较于其他组织，更能够长期大量蓄积在肝脏部位，因此可以作为肝脏相关疾病药物的优质候选载体[15]。基于上述独特优势，M-exo现已被证明具有作为载体递送药物[16]、免疫调节[17]、促进肠道上皮细胞增殖[18]以及作为奶牛健康的潜在标志物[19]等功能。目前对外泌体的探索主要集中在细胞通讯机制的研究[20]、作为药物递送载体[21]以及疾病标志物筛选[22]等方面。尽管如此，M-exo作为近年来逐渐兴起的优质载体，相关基础研究尚处于起步阶段。目前M-exo面临的挑战与其他不同来源的外泌体一样，其中一个关键问题是如何构建统一高效、可重复、标准化的提取分离和纯化方法。无论是口服给药还是静脉递送，若想在未来将M-exo发展为一种成熟的药物载体，首先，我们必须找到能够从牛奶中高效提取出纯度符合要求的外泌体的方法。故本研究拟使用超速离心法、酸性沉淀法和低温冷冻法三种方法从牛奶中提取外泌体，并对不同方法所得M-exo的形貌、大小和浓度等进行对比分析，进行细胞毒性，细胞摄取和组织分布的考察比较，由此来对比这三种提取方法的差异性，以及M-exo作为一种新型药物递送载体的开发潜能。我们希望选择出更加合理的M-exo提取方法，为日后探索M-exo的工业化生产条件提供参考，并为M-exo作为新型药物载体提供材料来源支持，进一步推动纳米递送系统的发展。
二、研究目的
本研究拟使用超速离心法、酸性沉淀法和低温冷冻法三种方法从牛奶中提取外泌体，并对不同方法所得M-exo的形貌、大小和浓度等进行对比分析，进行细胞毒性，细胞摄取和组织分布的考察比较，由此来对比这三种提取方法的差异性，以及M-exo作为一种新型药物递送载体的开发潜能。我们希望选择出更加合理的M-exo提取方法，为日后探索M-exo的工业化生产条件提供参考，并为M-exo作为新型药物载体提供材料来源支持，进一步推动纳米递送系统的发展。
三、工作进度安排
2月21日至3月20日：查找文献确定课题，撰写任务书；
3月21日至4月 1 日：使用超速离心法、酸性沉淀法和低温冷冻法提取牛奶外泌体；
4月 2 日至4月20日：不同提取方法所得牛奶外泌体的表征；
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