开题报告内容：
【拟研究和解决的问题】
研究关键基因CYP76AH1在丹参酮合成途径中对有效成分合成以及含量的影响。
【研究内容与方法】
- CYP76AH1基因片段的扩增
设计带有PstI和XbaI酶切位点的CYP76AH1特异引物，以丹参的cDNA为模板，使用高保真的KOD聚合酶进行PCR扩增，1%的琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR产物。
- 过表达载体的构建及转化。
将PCR扩增得到的基因CYP76AH1基因片段通过酶切反应与过表达载体pHB-GFP相连接，并通过测序验证得到构建成功的载体。提取质粒，并目标质粒转化C58C1菌株，检测为阳性pHB-gfp-CYP76AH1农杆菌加入适量甘油后保存备用。
- 丹参发根诱导及扩繁。
选取幼嫩的丹参苗，取幼嫩叶片剪成0.5cmsup2;,放入MS培养基中预培养，后与带CYP76AH1基因片段的发根农杆菌在frac12;MS＋AS培养基中共培养，最后转入frac12;MS＋IBA＋cef培养基中除菌培养，直至长出发根。
- 发根荧光显微鉴定。
选取培养继代45d以上，生长状况相同的同一批次发根，取根尖1cm左右切下，制片，放在倒置荧光显微镜下，在蓝色激发光源下观察。按照公式计算诱导率和转化率。
- 干扰型发根基因表达量测定。
采用Trizol法提取丹参发根总RNA。取0.1g新鲜发根在液氮中研磨粉碎，加入1mLTrizol室温放置10min充分裂解，4℃，12000r/min离心取上清，依次用氯仿、异丙醇和75%乙醇洗脱，最后用30uLDEPPC水溶解。用NANO Drop核酸定量仪测RNA浓度，取750ngRNA，反转录成总cDNA。Primer5.0设计RT-qPCR引物,以cDNA为模板，以空载为对照，利用实时荧光定量PCR检测发根中CYP76AH1基因的相对表达量。
【研究进度安排】
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