TNF-α诱导自噬紊乱介导神经元损伤的分子机理初探文献综述

一、实验的背景

1.程序性坏死介绍

程序性坏死（Necroptosis）是一种不同于凋亡及坏死的细胞程序性死亡方式。程序性坏死的激活依赖于受体相互作用蛋白（Receptor-interacting protein，RIP）的同源相互作用基序（RHIM），可由肿瘤坏死因子受体（Tumor necrosis factor receptor，TNFR）或模式识别受体（Pattern recognition receptor，PRR）调控启动。其作用机制为肿瘤坏死因子与肿瘤坏死因子受体结合导致复合体I和复合体II的形成，抑制了Caspase8的活性并导致了由RIPK1-RIPK3-MLKL组成的坏死小体的形成，MLKL的磷酸化及其在细胞膜结构的锚定，最终导致细胞膜的破裂并最终导致细胞的坏死性死亡。

2.肿瘤坏死因子驱动的程序性坏死的信号通路

肿瘤坏死因子（TNF）与肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）的结合导致TNFR1三聚化并且被激活。激活后TNFR1通过死亡结构域（DD domain）募集具有同型死亡结构的TNF关的DD蛋白（TRADD）以及受体相互作用蛋白1（RIP1或RIPK1），TRADD及RIPK1通过自身的DD进入激活的TNFR1的细胞内DD，启动复合物I的形成。在复合物I中，TRADD会募集TNF受体关联因子2蛋白（TRAF2）和细胞凋亡抑制蛋白1/2 （cIAP1/2），其中cIAP1/2以E3泛素化形式与TRADD连接。cIAP1/2向复合物I（包括RIPK1的K377 残基）添加K63线性泛素化装配复合物（LUBAC）连同去氢泛素化酶CYLD及其衔接蛋白SPATA2，并对RIPK1进行线性（M1）泛素化。复合物I的M1泛素结合蛋白，如ABIN1和视神经蛋白（OPTN）也被招募到复合物I中，ABIN1依次将泛素编辑酶A20招募到复合物I中。转化生长因子beta;活化激酶1 （TAK1）通过TAK1结合蛋白2（TAB2）或TAB3而被连接到RIPK1上的K63泛素链，形成TAK1-TAB2-TAB3复合物。NEMO-IKK复合物和激酶TBK1通过与RIPK1上的M1泛素链结合而被招募。如此，TAK1被募集到K63泛素化链上，IKK被募集到M1泛素化链上，TAK1与活化的IKK共同介导激活NF-kappa;B通路以及促炎和存活基因的转录，它们会抑制caspase8和RIPK1的活化。当NF-kappa;B激活被抑制后，一种叫做复合物IIa的胞质复合物可以介导caspase8的激活和随后的RIPK1裂解和RIPK1非依赖性凋亡。caspase8对RIPK1激酶结构域（KD）羧基末端（位于D324残基后）的切割提供了一个重要的机制，通过这个机制，无论是RIPK1依赖性的还是RIPK1非依赖性的细胞凋亡，都可以预先阻止RIPK1的激活和程序性坏死。当caspase8的激活被阻断时，RIPK1 通过其羧基末端（DD）的二聚化导致RIPK1的激活和复合物IIb的形成，IIb包括FAS相关DD蛋白（FADD）、caspase8、RIPK1、RIPK3和混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）。复合物IIb的形成需要RIPK1活性。泛素连接酶Pellino1（PELI1）介导复合物IIb中RIPK1的K63泛素化，促进RIPK3和MLKL活化，介导II型程序性坏死。而当在病理条件下，复合物I介导的capase8对RIPK1活性抑制失败时，RIPK1可能介导RIPK1 依赖性凋亡（步骤5）以及I型程序性坏死。在cIAP1/2缺陷条件下，或NEMO、IKK、TAK1缺陷条件下，在复合物I后可能会形成活化的不溶性泛素化RIPK1种类（iuRIPK1）。iuRIPK1 可加速RIPK1二聚并随后形成复合物II和RIPK1依赖性凋亡。如果caspase8的激活被阻断，复合物IIb（包括RIPK1、RIPK3和MLKL）的形成可导致I型程序性坏死。复合物I中活化RIPK1的高水平和iuRIPK1的形成将I型程序性坏死与II型程序性坏死区分开来，即RIPK1的高水平活化及iuRIPK1的形成意味II型程序性坏死的发生。坏死抑制素1s（Nec-1s）对RIPK1激酶的抑制阻断了RIPK1的活化，从而阻止了RIPK1依赖性细胞凋亡和II型程序性坏死。

3.神经退行性疾病的现状

神经退行性疾病是机体神经元结构或功能逐渐丧失而引发的一类疾病，这其中有帕金森氏病（Parkinsonrsquo;s disease，PD）、阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）、肌萎缩性侧索硬化（ALS）、亨廷顿氏病（HD）以及高雪氏病（Gaucher disease，GD）等。这类疾病病因尚不明确也没有有效治愈手段，且随着当下人口老龄化等趋势，相信AD在未来会有巨大的患者基数，同时也有人预告PD会影响到全球约400万人。严重的病情以及复杂的病理机制无意告诫人们对其病理机制的研究及治疗策略的研发是迫切的。

4.神经元损伤、神经退行性疾病与程序性坏死

神经元损伤是多种神经退行性疾病的病理基础。研究表明，程序性坏死是神经退行性疾病中神经元损伤的基础。目前，在上述的神经退行性疾病的发病中均检测到了细胞的程序性坏死的发生。多项证据表明，对程序性坏死信号通路的阻断对神经元损伤起到了缓解作用、对神经退行性疾病起到了有效积极的治疗作用。综上，对程序性坏死的研究有望为神经退行性疾病的治疗作出重大贡献。

二、研究的目的和意义

综上，本课题使用TNF-alpha;来诱导神经细胞产生自嗜紊乱从而研究程序性坏死在神经元损伤中的分子机理。通过监测程序性坏死信号通路中各个信号分子的表达水平，可以对程序性坏死的机理有更加明确的认识，这无疑对与神经退行性疾病乃至此外与程序性坏死相关的各种疾病的创新性治疗的研发起到了积极的作用。

三、实验内容

SHSY5Y细胞衍生于人的神经母细胞瘤细胞系SK2N 2SH，被广泛运用于PD 发病机制的研究。PC12细胞系是来源于成年大白鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤的细胞系，培养PC12细胞系可观察PC12细胞动力学及其演化形成神经细胞与胶质细胞的过程。

本实验培养SH—SY5Y神经细胞、PC12神经细胞，将细胞分为对照组、给药组（TNF、TNF zVAD、TNF zVAD Smac-mimetic），于不同培养周期、不同药物浓度分别给药。而后细胞收样后进行Western Blot、qPCR、激光扫描共聚焦分别监测蛋白信号分子含量、计算目标基因水平含量、观察细胞形态，从而确定程序性坏死信号通路的分子水平特征、对神经细胞的影响。

四、参考文献

[1]Shuo Zhang, Mi-bo Tang, Hai-yang Luo, Chang-he Shi, Yu-ming Xu. Necroptosis in neurodegenerative diseases: a potential therapeutic target. Citation: Cell Death and Disease 2017; 8: 1-8.

[2]吴轶群, 徐翀, 魏立彬. 细胞程序性坏死机制及其在神经退行性疾病发生发展中的作用. 世界最新医学信息文摘 2019; 19(78): 52-54.

[3]Junying Yuan1, Palak Amin, Dimitry Ofengeim. Necroptosis and RIPK1-mediated neuroinflammation in CNS diseases. Nature Reviews Neuroscience 2019; 20: 19-33.

[4]巴微, 逄越, 李庆伟. 程序性坏死（Necroptosis）的分子机制. 遗传 2014; 36(6): 519-524.