开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一.课题背景
黑色素瘤是一种起源于黑素细胞的皮肤恶性肿瘤，是一种高度侵袭性的最致命的一种肿瘤[1,2]。据统计，每年全世界估计有超过28万新发患者，死亡病例6万多。全球范围内，发病率和死亡率差异明显[3], 威胁着人类健康。
研究报道了多种黑色素瘤的临床治疗手段，包括早期手术切除、化学疗法、放射疗法[5]，但晚期高死亡率和高复发率问题仍然是当前临床面临的巨大挑战。近年来，免疫疗法尤其是免疫检查点阻断疗法（immune checkpoint blockade, ICB）在抗肿瘤领域取得了显著的成果[4]。不同于传统的化学疗法，免疫治疗是以免疫系统为作用靶点，通过阻断免疫抑制通路或直接发挥免疫刺激作用，以增强机体的抗肿瘤免疫反应[8]。免疫检查点是指免疫系统中存在的各种抑制性信号[9]，抑制免疫细胞活化的蛋白，可产生活化抑制信号，避免T细胞的过度激活[6]。免疫检查点包括细胞毒性 T 淋巴细胞抗原(cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4) 、程序性死亡蛋白1及其配体(programmed cell death1 / programmed cell death 1 ligand，PD-1/PDL-1)[7]。肿瘤细胞利用免疫检查点抑制T细胞的活性是肿瘤免疫逃逸的主要机制之一[10]。艾利森与Medarex公司合作开发出了抗 CTLA-4单抗MDX010(Ipilimumab)，在多项治疗晚期黑色素瘤患者的临床研究中取得了显著疗效[16,27]。Hodi等人将糖蛋白100（Gp100）肽疫苗与Ipilimumab结合治疗，建立了免疫联合治疗体系。Gp100肽疫苗单独治疗可以诱导免疫反应, Ipilimumab阻断CTLA-4以促进抗肿瘤免疫，两者结合成功地同时促进抗肿瘤免疫，有效地提高了黑色素瘤患者生存率[26]。Ono制药公司与BMS公司合作开发了针对PD-1的临床级抗体 Nivolumab，Ⅰ期研究中296名患者使用抗PD-1抗体,黑色素瘤患者出现客观缓解，其中大多数持久缓解，有些肿瘤完全消退[6]。因此PD-1阻断免疫疗法在抗肿瘤治疗方面效果显著。
但免疫检查点阻断疗法仍有缺陷，肿瘤细胞的免疫原性低以及存在复杂的肿瘤免疫微环境降低了免疫检查点阻断治疗的疗效，患者的临床应答率低[12]。一些来自肿瘤细胞的抗原太弱，无法引发特异性免疫反应。癌细胞还往往比正常细胞表达更多的粘蛋白和多糖分子来隐藏肿瘤抗原。抗原的这些不定向改变阻碍了免疫细胞对癌细胞的识别[15,16]。另一方面，肿瘤免疫微环境会抑制辅助性 T细胞（CD4）、杀伤性T细胞（CD8）、B细胞、树突状细胞和巨噬细胞的抗癌功能[13,14,15,16,17]。因此，寻找合理的策略提高肿瘤细胞免疫原性并调控肿瘤免疫抑制微环境是改善免疫检查点阻断疗法的有效手段。
一氧化氮( NO) 是心血管系统、免疫系统和中枢神经系统中重要的信号分子。一氧化氮在适应性免疫细胞的发育、分化、激活等多种过程中发挥重要作用，同时对适应性免疫反应参与的自身免疫病、心血管疾病、病毒感染等多种病理过程具有重要的调控作用[11]。近年来，很多证据表明，一氧化氮对肿瘤的生长和转移有直接作用，对肿瘤也有抑制作用[20,22,28]。例如，R Farias-Eisner等人建立了小鼠卵巢畸胎癌细胞系动物模型，并诱导其巨噬细胞产生一氧化氮，在与无免疫功能的小鼠对照组比较后，发现了一氧化氮对肿瘤细胞的抑制功能[28]。Ilaria Marigo等人建立了EG7淋巴瘤野生型(WT)小鼠模型，与缺乏一氧化氮合成小鼠模型对照，发现肿瘤浸润的髓样细胞产生的局部一氧化氮(NO)对过继转移的细胞毒性T细胞破坏肿瘤非常重要[19]。Bonavida等人将一氧化氮与化学疗法结合用以治疗肿瘤，发现高浓度的一氧化氮供体使肿瘤细胞对凋亡基因更加敏感[21]。有效的肿瘤免疫治疗需要克服免疫抑制的肿瘤微环境，而一氧化氮可以刺激相关免疫细胞的激活和分化，突破肿瘤的免疫抑制。例如，Padmini等人建立了携带MT-RET-1黑色素瘤的野生型小鼠模型，发现辅助性T淋巴细胞中一氧化氮表达抑制调节性T细胞(Tregs)的分化来破坏肿瘤耐受性[23]。Niedbala等人发现低浓度一氧化氮能够有效促进T细胞的增殖和分化。在体外，NO增加了人多发性骨髓瘤细胞系DNAX辅助分子(dNaM-1)配体的表达，使肿瘤更容易受到自然杀伤细胞(NK)和T淋巴细胞的杀伤[20]。由此可知，一氧化氮在T细胞介导的抗肿瘤作效应中发挥着重要作用并且可应用于肿瘤的临床治疗。所以引入一氧化氮可以辅助免疫检查点阻断治疗黑色素瘤，增强肿瘤的免疫原性。
本次课题构建了基于上转换纳米颗粒的一氧化氮载药系统联合免疫检查点阻断疗法实现改善的抗肿瘤免疫治疗。上转换纳米颗粒(UCNPs)是主要由稀土离子掺杂的氧化物、氟化物和卤氧化物形成的纳米粒子，具有光学稳定性好、寿命长、毒性低、对组织损伤小并且组织穿透性强等优点[18,24]。因此，可以借助上转换纳米粒子作为载体构建NO递送系统，实现对黑色素瘤细胞的抗肿瘤免疫治疗。在近红外光照射下，该复合纳米粒子释放NO，对肿瘤细胞起到直接杀伤作用，最终实现抗肿瘤免疫治疗。
二. 要解决的问题
1. 研究肿瘤细胞对含有一氧化氮载药系统的细胞内吞效率。
2. 研究肿瘤细胞内一氧化氮释放量。
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