：一、 背景介绍： 作为生物界最古老哺乳动物之一的蝙蝠，据推测和很多病毒有着相同的起源时间，并且在500多万年的进化史上没发生太大变化[1]。蝙蝠与许多病毒经历了共同抗争，共同进化[2]，并可能拥有和病毒相互适应的特殊免疫机制。加之种群数量大，高密度群居的生活习性，病毒得以在种内快速传播。并可通过冬眠[3]淘汰病毒敏感个体，这使得蝙蝠自然成为许多病毒的储存宿主[4]，包括多种高致病性病毒。其携带的许多病毒的亲嗜受体在哺乳动物中较为古老和保守，而且作为生物界哺乳动物中仅次于啮齿类第二大动物群体，其种类数量繁多，分布广，拥有长距离飞翔能力，以及和人类重叠的居住和活动范围，这些特性使得蝙蝠易于将病毒传播给人类和其他动物[5]。目前，通过各种方法在蝙蝠体内已经检测到 130多种病毒，其中60多种病毒是烈性人兽共患病病原体,可引起人的重大传染病，其中包括SARS样冠状病毒以及新的MERS 冠状病毒等[6]。 2002-2003年SARS 暴发，很快SARS冠状病毒(SARS-CoV)的动物源性就被确定,之后香港大学微生物系和中科院的研究人员分别发表文章宣布从菊头蝠科的蝙蝠中检测出蝙蝠SARS样冠状病毒(Bat-SARSCoV),与人SARS冠状病毒的核甘酸同源性gt;88%,并且从菊头蝠科的成员中检出很高的抗体阳性率[7][8]。因此,研究人员将冠状病毒的自然宿主锁定在蝙蝠上,对野生蝙蝠所携带的冠状病毒展开了一系列的研究,结果发现,蝙蝠所携带的冠状病毒基因多样性极其丰富,迄今为止已经从蝙蝠中发现了十几种新的冠状病毒[9]。但是通过对冠状病毒与宿主受体结合的S蛋白基因编码区的同源性分析表明,bat-SARSCoV与SARS-CoVS基因的同源性仅为64%,受体分析也显示bat-SARSCoV不能结合人的血管紧张素转换酶2（ACE-2）受体,因此,SARS-CoV的直接祖先还未被发现,从感染动物宿主到感染人宿主的进化历程也没有完全搞清楚,对已发现的冠状病毒进行的系统进化分析也表明还有更多新的冠状病毒没有被发现,现在已知的可能只是自然界中的冠状病毒一个很小的子集[10]。鉴于蝙蝠携带冠状病毒基因型多态性丰富,以及蝙蝠的生态学特性,期望从中发现其他与SARS-CoV更为同源的冠状病毒,描绘出病毒在自然宿主中的详细进化历程,有助于预防和控制SARS的再次爆发流行。2012年，中东地区暴发的新型冠状病毒肺炎被查出是由 MERS-CoV 造成的[11]，该病毒与我国香港的 Bat-cov-HKU4 和 Bat-cov-HKU5 同源性超过 90%。随后的溯源调查显示，该病毒在加纳和西北欧的伏翼蝠和裂颜蝠中的阳性率为 15%和 25%，且部分基因的同源性高达 93%以上。这些研究结果预示着蝙蝠很可能是最近中东地区流行的冠状病毒病的传播来源。随着越来越多新发致病的冠状病毒在蝙蝠体内发现，人们逐渐认识到研究蝙蝠所携带的冠状病毒在流行病预治方面有重大意义。 冠状病毒属于巢式病毒目( Nidovirales) 、冠状病毒科、冠状病毒属，因在电子显微镜镜下观察到其病毒颗粒形似王冠而得名[12]。冠状病毒粒子为多形态，略呈球形，成熟的冠状病毒直径为 60 ～ 220 nm。病毒基因组为线性单股正链ＲNA，是迄今为止已发现的基因组最大的ＲNA病毒。病毒基因组全长在 27 ～31 kb 之间，基因组ＲNA可作为 mＲNA，具有感染性[13]。距 5端约 2/3 的基因组包含两个大的重叠开放阅读框，主要负责编码与病毒复制、转录相关的酶等非结构蛋白。余下约 1/3 的基因组负责编码刺突蛋白( Spike，S) 、小膜蛋白( Small envelope membrane，E ) 、膜蛋白 ( Membrane，M ) 和核衣壳蛋白( Nucleocapsid，N) 等主要结构蛋白。其中S蛋白是病毒主要抗原，具有受体结合和膜融合活性，在组织嗜性、细胞融合和毒力等方面起重要作用[14]。研究S蛋白的结构与功能，尤其是与其受体的相互作用关系．有助于开发新的抗冠状病毒药物．预防和治疗相关疾病。 本课题以东南沿海物产丰富地区所采集的蝙蝠为样本，用核酸法鉴定该区域内，蝙蝠所携带的冠状病毒的种属，扩增出该病毒的全基因组，对该病毒做进化分析，比对同源性，探究其在动物间传播的可能性和致病机制，为后续防控研究提供依据。 二、拟研究的问题： 1. RT-PCR扩增出采集自东南沿海地区的蝙蝠所携带的冠状病毒全基因组。 2. 使用数据库进行病毒全基因组进化分析[15]，并鉴定病毒的种属，并对S蛋白作氨基酸分析[16]。3. 用携带病毒的蝙蝠组织匀浆上清液攻Rat乳鼠，使用巢式PCR检测病毒以及组织嗜性，电镜观察病毒形态，组织病理观察。4.重组表达S蛋白，测定受体结合力，研究S蛋白的抗原性和免疫原性[17]。
三、计划的实验内容简述： 1. 实验样本的采集，试剂盒和实验耗材的准备，引物的设计合成： 该研究所于2016年7月和2017年2月到舟山市、厦门市、福州市下属的十多个县区采集蝙蝠标本约四百多只，解剖冻存运回实验室。并购买大连宝生物公司的DNA/RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒，rTaq酶和GXL高保真酶。利用数据库和生物学软件设计PT-PCR扩增引物和Cov巢式PCR引物。2.蝙蝠组织RNA的提取、逆转录，基因组片段的扩增、测序，全基因序列的拼接，S蛋白的氨基酸序列分析： （1）取火柴头大小的蝙蝠肠组织，加入PBS缓冲液于研磨器中研磨成组织匀浆，离心取上清、除菌滤膜过滤，取合适体积的上清液提取RNA，-80℃冻存其余上清。对RNA洗脱液进行逆转录获得cDNA。 （2）取合适体积的cDNA溶液进行GXL Cov巢式PCR扩增，取阳性结果的cDNA溶液进行Cov基因组片段扩增，取合适的扩增结果送基因公司测序。对测序结果进行比对、拼接、分析，重点对S基因做氨基酸分析。3. 用GXL Cov巢式PCR扩增阳性的蝙蝠组织匀浆上清液攻Rat乳鼠（出生1~2天，颅内），两周后取血清并处死乳鼠，取乳鼠脑、肠、肝、肺、肾、脾组织，每份组织分别取适量于甲醛和戊二醛溶液中4℃保存，其余组织取适量提取RNA后-80℃保存，将提取的RNA逆转录为cDNA用GXL Cov巢式PCR检测病毒感染结果和病毒的组织嗜性，把相应的保存在戊二醛溶液中的组织送电镜观察病毒形态，保存在甲醛溶液中的组织送光学显微镜做病理观察。4.扩增S基因，构建重组表达载体，选择合适的表达系统表达S蛋白，提取纯化，探究S蛋白的抗原性和免疫原型。
四、参考文献：1. Teeling EC, Springer MS, Madsen O, Bates P, OBrien S J et al. A molecular phylogeny for bats illuminates biogeography and the fossil record. Science, 2005, 307(5709): 580-584.2. Field H, Young P, Yob J M, Mills J, Hall L, Mackenzie J. The natural history of Hendra and Nipah viruses. Microbes Infect, 2001, 3(4): 307-3143. Sulkin S E, Allen R, Sims R. Studies of arthropod-borne virus infections in CHiroptera.3. Influence of environmental temperature on experimental infection with Japanese B and St. Louis encephalitis viruses. Am J Trop Med Hyg[J], 1966,15(3): 406-417.4. 何彪, 涂长春. 蝙蝠病毒研究进展[会议论文] . 2013.5. de Groot RJ, Baker SC, Baric RS, et, al. Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV):announcement of the Corona viras Study Group. J Virol 2013, 87: 7790-7792.6. Calisher CH, Childs JE, Field HE, Holmes KV, Schountz T. Bats: important reservoir hosts of emerging viruses. Clin Microbiol Rev, 2006, 19(3): 531-545.7. Lau SK, Woo PC, Li KS, et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-like virus in Chinese horseshoe bats[J].Proe.Natl.Aead.Sei.USA,2005,102:14040一1404.8. Tang XC, Zhang JX, Zhang SY, et al. Prevalence and genetic diversity of corona virus in bats from China[J].J.Virol.,2005,80:7481一7490.9. KimH K，Yoon SW，Kim DJ，et al．Detection of Severe Acute Respiratory Syndrome-Like，Middle East Respiratory Syndrome-Like bat coronaviruses and group h rotavirus in faeces of Korean bats．Transbound Emerg Dis[J]，2016，63(4)：365372．10. Woo P C, Lau S K, Li K S, Poon R W, et al. Molecular diversity of coronaviruses in bats. Virology[J],2006, 351(1): 180-187.11. Zaki AM, van Boheemen S, Bestebroer TM,et al. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. NEngl JMed [J].2012,367: 1814-182012. Tyrrell DAJ, D.M.Berry，C.H.Cunningham. Corona virus[J].Nature,1968，220：650-659．13. Rota PA, Oberste MS, Monroe SS, et al. Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Science[J] 2003, 300: 1394-1399.14. Simmons G, Reeves JD, Rennekamp AJ, et a1．Bates P：Characterization of severe acute respiratory syndrome-associated corona virus(SARSCoV)spike glycoprotein mediated viral entry[J]. Proc Natl Acad Sci, 2004, 101:4240-4245．15. 王依，沈谷芳,胡丹等. 蝙蝠圆环病毒ＢｔＣＶ－ＤＳ１３株的鉴定与全基因组分析.病毒学报，2017，3：82-88.16. 何彪．蝙蝠病毒组学及其新病毒的发现与鉴定．军事医学科学院军事兽医研究所，军事医学科学院博士学位论文，2014-06-l0.17. 崔杰. 关于蝙蝠携带冠状病毒以及乙脑病毒的研究. 河北师范大学硕士毕业生学位论文, 2008-04-10.
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