一、课题背景
颗粒酶是外源性的丝氨酸蛋白酶。截止目前，在人类中发现了五种颗粒酶：颗粒酶A, B, H, K和M，而鼠中存在颗粒酶A, B, D, E, F, G, K, L, M和N[1]。颗粒酶B（GrB）是其中最丰富的一类[2]。19世纪80年代，科学家第一次在杀伤性T细胞和NK细胞胞浆颗粒中发现了它[3]。研究表明，超过三百种细胞内和细胞外的人类蛋白质为GrB的潜在底物。另外，与肿瘤坏死因子家族FASL和TRAIL等成员相比，GrB可直接激活细胞凋亡机制，而前者则需要完整的受体和下游信号通路来诱导启动和效应caspases的激活，故颗粒酶B可以确保即使其他途径被阻断也能诱导细胞凋亡。GrB存在多种诱导细胞凋亡途径的方式，包括直接caspase级联凋亡途径和线粒体凋亡途径。Caspase依赖性凋亡是指GrB可直接水解procaspase-3和7，活化的caspase-3和7通过裂解细胞质和细胞骨架中的结构蛋白和调控蛋白，进而引起细胞凋亡[4]。而线粒体凋亡途径则是指颗粒酶通过两种方式引起线粒体外膜通透性增大而导致细胞凋亡。GrB裂解“BH3-only”蛋白——Bid，形成的tBid迁移到线粒体外膜，激活Bax和/或Bak，Bax或Bak低聚化，使得线粒体外膜完整性受到破坏，释放细胞色素C、Smac、HtrA2、AIF和Endo-G等。细胞色素C进入胞质后，和Apaf-1，procaspase-9形成凋亡小体，导致caspase-9被激活，caspase-9可进一步激活caspase-3和7。同时，Smac可抑制凋亡抑制蛋白XIAP的抑制作用[5]。另外，GrB也可以通过破坏Bim·Mcl-1复合物来引起线粒体外膜通透性增大，释放细胞色素C等分子诱导凋亡。GrB还可以直接酶解胞质中的管家蛋白以及转运至细胞核，酶解核蛋白来诱导细胞凋亡。因此GrB具有很强的细胞毒性及诱导细胞凋亡的能力，作为一种蛋白类药物，具有广泛的应用前景。
- 要解决的问题
利用颗粒酶B诱导肿瘤细胞凋亡是具有潜力的，但难点之一是它在生理条件下需要借助穿孔素的协助才能进入靶细胞。研究认为, 膜裂解蛋白穿孔素( perforin)以单体形式插入靶细胞膜, 并依赖Ca2 形成多聚体跨膜通道, 使GrB入胞[6]。但是穿孔素在体外不稳定，并且有钙依赖性，所以要寻求新方法将颗粒酶B递送至靶细胞处。
- 可行性分析
研究表明，将天然细胞膜转移到合成纳米粒子表面可以赋予人造载体以内源细胞的优点和功能，这就使得该仿生系统既保留了纳米材料的物理化学性质，又具有内源细胞的生物学功能，从而实现了高效的药物传递[7]。这种细胞来源的仿生纳米粒子是治疗癌症药物的优良载体，具有如下生物学优势：
- 体内循环时间长：与递送靶点进行多次交互
- 主动靶向病变组织：促进药物递送至靶位并避免脱靶引起的副作用
- 药物控制释放：确保向靶细胞的充分递送和给药
- 生物相容性高：免疫原性低，促进降解并最终从体内清除
本课题采用巨噬细胞作为天然细胞，但是在巨噬细胞膜中直接加载游离药物会导致药物加载量较少或药物过早释放，从而阻碍药物向靶细胞的递送[8]。由于纳米颗粒具有包埋、保护和释放特定剂量的治疗药物的能力，使其成为纳米药物药物递送的理想载体。巨噬细胞还具有穿越屏障（例如血脑屏障）并将纳米颗粒从循环系统运送到体内难以到达的区域（例如肿瘤中的低氧区域）的能力，这可以解决纳米颗粒疗法中组织渗透受限的问题[9]。
- 研究方法和内容
本课题构建了一个稳定高效的载体实现了颗粒酶B的单独递送，将巨噬细胞膜和光敏性脂质体融合，以颗粒酶B和光敏剂为核心，形成了一个仿生的光控纳米递药系统。前期对载体的包封载药，稳定性，光控释药等物理化学性质进行了表征，后期将评估载体的细胞靶向，细胞杀伤等能力。
- 工作计划
2月28日—3月20日：完成文献查阅、开题报告等前期工作。3月21日—5月10日：完成评估载体的细胞靶向能力，细胞杀伤能力，空载体的安全性评价等
工作。
5月11日—5月20日：完成毕业论文的撰写工作。
5月21日—6月04日：完成毕业论文的评阅、答辩与修改工作。
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