基于Wnt/β-Catenin信号通路的CLK2抑制剂设计及构效关系研究文献综述

 2022-12-02 08:12
  1. 课题背景

骨关节炎(OA)是最常见的关节炎类型。骨关节炎影响着大约3000万美国成年人，是世界范围内致残的主要原因[1]。OA是一种完整的关节疾病，以软骨退化、骨改变和滑膜炎症为特征，导致关节间隙狭窄、疼痛和功能丧失[2]。虽然抗炎药物广泛应用于OA对症治疗，但这些药物并没有显示出在减缓结构进展方面的好处，因此手术干预是唯一的选择。对疾病修饰性OA药物(DMOAD)的需求尚未得到满足，DMOAD有助于疼痛和功能，并减轻OA引起的结构性损伤。发展DMOAD的方法包括软骨再生，抑制炎症或软骨分解酶，用生长因子刺激软骨细胞，恢复软骨稳态[3-6]。

Wnt通路在物种间高度保守，在器官发生、细胞分化和组织重塑中发挥核心作用[7]。典型的Wnt信号是由Wnt蛋白与卷曲蛋白(FZD)受体结合而启动的，导致细胞质beta;-Catenin蛋白破坏复合物的破裂。稳定的 beta;-Catenin蛋白易位到细胞核，并与T细胞因子/淋巴样增强因子(TCF/LEF)转录因子相互作用激活Wnt靶基因表达[8]。Wnt信号在多个水平上受到严格调控，导致大多数组织内的稳态信号。在关节中，稳态水平的Wnt信号对于干细胞增殖、软骨细胞分化和功能是必不可少的，beta;-Catenin蛋白的缺失和激活都会导致关节损伤[9,10]。Wnt信号在OA关节组织中上调，并驱动骨分化、软骨退化、软骨细胞肥大和炎症[11]。考虑到Wnt信号在OA发病机制中的这些核心作用，调控beta;-catenin下游的Wnt通路提供了一种有前景的方法。

调控基因表达可以通过多种机制实现，包括转录因子磷酸化的转录控制和选择性剪接的转录后调控。95%的人类基因是可选剪接的[12]，通过包含或排除内含子和外显子，从单个基因产生多种蛋白质[13]。剪接受到多种机制的调控，包括pre-mRNA结合蛋白的磷酸化，如富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子(SRSF)[13]。而CLKs通过富丝氨酸和精氨酸(SR)蛋白的磷酸化调节选择性剪接，从而促进剪接体的组装[14]。

通过下调CLK2和CLK2特异性抑制剂抑制Wnt通路活性，支持CLK2或其下游成分在转录后水平参与调控Wnt信号，可能通过对Wnt靶基因的选择性剪接。CLK2的缺失或抑制可能影响了基因的pre-mRNA处理(如TCF7)，导致转录本的不稳定形成，并对随后的基因表达产生整体抑制作用[15,16]，从而抑制Wnt通路基因的表达，促进软骨保护，增强软骨细胞在体内外的功能。

Lorecivivint(原名SM04690)一种潜在的DMOAD和小分子Wnt通路抑制剂，已经显示了有希望的OA治疗效果，诱导软骨细胞分化，软骨再生和保护，并在手术诱导的关节不稳定(前交叉韧带横切，部分内侧半月板切除术;ACLT pMMx)大鼠OA模型[17]，在本报告中，SM04690通过抑制核内激酶，在体外和体内的OA模型中描述了Wnt通路调节、软骨细胞分化、抑制软骨降解和抗炎作用的新机制。SM04690在大鼠OA模型中诱导软骨形成并抑制关节破坏，是一种潜在的疾病修饰治疗OA的候选药物。

  1. 要解决的问题

对于改进的OA治疗药物有一个巨大的未满足的需求。目前的治疗方法只关注疼痛或炎症，而且大多数药物的开发只针对疾病的一个方面。之前报道的针对CLKs或DYRK1A的化合物既缺乏激酶特异性，也缺乏作为潜在治疗候选药物的细胞能力。虽然CLK2似乎是SM04690抑制Wnt通路、软骨细胞分化和保护的主要靶点，但除了抗炎作用外，CLK1、CLK3、CLK4和其他细胞蛋白或通路的作用也不能排除[18]。所以需要深入研究SM04690对Wnt通路的调控机制，以及设计合成SM04690衍生物，确定生物学活性以及构效关系，寻找新型有效的OA治疗药物。

  1. 可行性分析

SM04690是一种新的、有效的、特异性/选择性的典型Wnt信号通路抑制剂，其EC50为19.5 nM，可抑制SW480结肠癌细胞中的TCF/LEF报告基因。在多个细胞试验中，它比其他已知的Wnt抑制剂的效力高出150- 500倍。与载体相比，SM04690诱导hMSC(人间充质干细胞)分化为成熟的、有功能的软骨细胞，并降低了软骨分解代谢标记物水平。与载体相比，单个SM04690关节内注射(IA)在啮齿动物OA模型中有效，增加了软骨厚度，软骨再生的证据，并观察到对软骨分解代谢的保护，导致国际骨关节炎研究协会(OARSI)组织学评分和生物标志物显著改善[19]。

使用SM04690 (0.5 mM)的生化分析显示，与DMSO相比，在318个激酶中，有7个激酶受到ge;90%的抑制。CLK2是最有效的抑制激酶(IC50=5.8nM)，其他6个激酶的IC50抑制率ge;90%，在CLK2 IC50的15倍以内。DYRK1A与CLKs在相同的CMGC激酶组中，IC50=26.9 nM。总的来说，SM04690对野生型激酶表现出选择性(抑制率ge;90%或IC50le;100 nM，占318种激酶的2.5%)[20]。

利用CLK2对SM04690进行计算建模，识别出多个氢键、供体受体位点潜在驱动SM04690活性。SM04690与该激酶的ATP结合位点对接，与CLK2中的GLU244、LEU246和LYS193形成氢键。对于CLK2, 100次停靠中有100次在2Aring;均方根距离内着陆(RMSD;对接能量为-12.8plusmn;2.0kcal/mol)。预测的结合模式将完全阻断ATP的结合，从而抑制CLK2的功能[21]。

体外生化检测CLK2证实了SM04690对CLK2 (IC50= 7.8 nM)的抑制作用。与CLK2抑制剂(CC-671、TG003、ML167、leucetine L41、ML315)相比，SM04690的效力是其他化合物的2-300倍[22-26]。

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